許弟群 林 玲 梁惠娟 劉 飛 曹 芳

(1.漳州師范學(xué)院體育系,福建漳州 363000;2.上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

許弟群1,2林 玲1梁惠娟1劉 飛1曹 芳1

(1.漳州師范學(xué)院體育系,福建漳州 363000;2.上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

為研究運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對機(jī)體免疫功能的影響以及為針對性的干預(yù)手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過對小鼠進(jìn)行為期6周的不同負(fù)荷的游泳訓(xùn)練,采用氚標(biāo)記胸腺嘧啶摻入法(3H-TdR)測小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化;流式細(xì)胞儀對T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分型。結(jié)果顯示:經(jīng)過6周的游泳訓(xùn)練后,45min訓(xùn)練組在淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、NK、CD3、CD4、CD4/CD8顯著高于對照組和力竭組(P＜0.01),CD8與對照組比較有上升趨勢,無顯著意義,但顯著低于力竭組(P＜0.01);而力竭組在淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、NK、CD3、CD4、CD4/CD8顯著低于對照組和45min訓(xùn)練組(P＜0.05),CD8顯著高于對照組和45min訓(xùn)練組(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)表明:大負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練將導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降;而適當(dāng)運(yùn)動(dòng)有利于機(jī)體免疫功能增強(qiáng),提高抗感染能力。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練;小鼠;免疫功能

近年來,隨著免疫學(xué)的迅猛發(fā)展,有關(guān)運(yùn)動(dòng)與機(jī)體免疫機(jī)能之間的關(guān)系研究越來越受到運(yùn)動(dòng)免疫學(xué)家、運(yùn)動(dòng)生理學(xué)家等的重視。有研究表明,大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練期和耐力比賽后,上呼吸道感染率和患病率提高[1]。為探討過度訓(xùn)練免疫功能降低的機(jī)理,本研究通過以Balb/C小鼠為研究對象,將其進(jìn)行為期6周的力竭性游泳訓(xùn)練,采用氚標(biāo)記胸腺嘧啶摻入法和流式細(xì)胞儀檢測它們的免疫細(xì)胞變化,從細(xì)胞水平探討不同負(fù)荷訓(xùn)練對免疫功能的影響及其生物學(xué)意義,為研究不同負(fù)荷訓(xùn)練對機(jī)體免疫功能的影響以及針對性的干預(yù)手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及喂養(yǎng)

30只雄性Balb/c小鼠,體重20-22g,8-10周齡,由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號為:SCXK-(閩)-2008-0001。小鼠分籠飼養(yǎng),每籠5只,飼養(yǎng)選用塑料制品,并配用不銹鋼罩、玻璃吸水瓶和不銹鋼吸水管,飼養(yǎng)溫度為25±2℃,國家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料喂養(yǎng),自由飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 運(yùn)動(dòng)條件塑料水槽120×60×50cm3,水深40cm,超過小鼠體長兩倍,水溫33±2℃,濕度50%-70%,自然晝夜節(jié)律。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)方式無負(fù)重游泳。

1.2.3 訓(xùn)練方案

1)對照組 平時(shí)不運(yùn)動(dòng),飼養(yǎng)條件與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組相同。

2)45min訓(xùn)練組 前3天適應(yīng)性游泳30min,然后每天延長5min,直至游泳45min,然后每天游泳1次,每周6次,持續(xù)5周,訓(xùn)練時(shí)間共6周。

3)力竭組 前3天,適應(yīng)性游泳30min,并在1周內(nèi)延長至120min,訓(xùn)練1周后,對小鼠進(jìn)行力竭性游泳訓(xùn)練,力竭標(biāo)準(zhǔn)[2]:小鼠沉入水中超過10s,且放在平面時(shí)無法完成翻正反射。每天1次,每周6次,持續(xù)5周,訓(xùn)練時(shí)間共6周。力竭組運(yùn)動(dòng)后期死亡2只。

1.3 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基,RPM1640培養(yǎng)基,ConA均為Sigma公司產(chǎn)品。熒光素標(biāo)記小鼠CD3、CD4、CD8、NK1.1抗體購自深圳達(dá)科生物技術(shù)有限公司。

流式細(xì)胞儀:由Becton Dickinson公司生產(chǎn),型號為FACSCalibur。

1.4 取材及測試方法

1.4.1 單個(gè)脾細(xì)胞的制備

小鼠末次游泳訓(xùn)練后24h,稱重,頸椎脫臼處死小鼠后,將小鼠全身用75%的酒精消毒,無菌取脾,放入4ml無菌小牛血清的1640培養(yǎng)液中,用毛玻璃片磨碎,并用四層紗布過濾,將細(xì)胞懸液移入帶蓋的無菌試管中,用Hanks液洗三次,每次離心10min(1000轉(zhuǎn)/min),棄上清液。

1.4.2 免疫功能的測定

1)淋巴細(xì)胞對ConA增殖反應(yīng) 用3H-TdR摻入法[3]。

2)T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞活性測定 取1×107個(gè)/ml的小鼠脾單細(xì)胞懸液100μl于falcon管中,分別加入CD3FITC、CD4PE、CD8-PE、NK1.1-PE抗體,震蕩搖勻,室溫避光放置30min,用PBS洗滌2遍,再加入500μl的PBS混勻,用流式細(xì)胞儀FACSCalibur在CELLQuest功能軟件下進(jìn)行雙參數(shù)獲得數(shù)據(jù)分析脾淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8、NK1.1陽性表達(dá)率及CD4/CD8比值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

運(yùn)用SPSS16.0軟件包處理,計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差(M± SD),組間比較采用t檢驗(yàn)。顯著性水平確定為0.05,非常顯著性水平確定為0.01。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)結(jié)果

本試驗(yàn)表明,經(jīng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后,小鼠脾淋巴細(xì)胞對ConA分裂原的增殖反應(yīng)45min訓(xùn)練組比對照組和力竭組比較顯著提高(P＜0.01),而力竭組增殖反應(yīng)比其他兩組顯著降低(P＜0.01),試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對小鼠脾T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

2.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對小鼠NK細(xì)胞的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析FITC-CD3及PE-NK雙染的運(yùn)動(dòng)小鼠脾細(xì)胞時(shí),可得出NK細(xì)胞數(shù)量,從圖1和表2可知, 45min訓(xùn)練小鼠脾細(xì)胞中NK細(xì)胞比較對照組和力竭組顯著增加(P＜0.01),而過度訓(xùn)練小鼠脾細(xì)胞中NK細(xì)胞比較另兩組組相比顯著下降(P＜0.01)。

圖1 NK細(xì)胞活性檢測流式細(xì)胞儀鎖定細(xì)胞圖像圖譜

將圖譜中(見圖1)代表NK的鎖定細(xì)胞數(shù)熒光偏轉(zhuǎn)扣除空白對照相應(yīng)數(shù)值,得到NK細(xì)胞的含量百分值,計(jì)算出比值,采用Spss16.0的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果見表2。

表2 不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對小鼠NK細(xì)胞比例的影響

2.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對小鼠T細(xì)胞亞群的影響

表3可知力竭訓(xùn)練組較其他兩組CD3、CD4有和CD4/ CD8比值顯著下降,CD8顯著升;而45min訓(xùn)練組CD3、CD4和CD4/CD8比值顯著上升,CD8水平有上升趨勢,但無顯著意義。

將圖譜中(見圖1)代表CD3、CD4/CD8、CD8/CD4的鎖定細(xì)胞熒光偏轉(zhuǎn)扣除空白對照值,得到CD3、CD4/CD8、CD8/ CD4的細(xì)胞含量百分值,計(jì)算出的比值,采用Spss16.0的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果見表3。

表3 不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對小鼠脾T細(xì)胞亞群的影響

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對小鼠T淋巴細(xì)胞功能的影響

有關(guān)運(yùn)動(dòng)后淋巴細(xì)胞對絲裂原的增殖反應(yīng)性變化,在運(yùn)動(dòng)與免疫研究領(lǐng)域有很多報(bào)道。郭建軍等[4]研究發(fā)現(xiàn),大鼠進(jìn)行4周大強(qiáng)度的間歇性訓(xùn)練,脾細(xì)胞對ConA及LPS的增殖能力下降;馮建英[5]以大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,發(fā)現(xiàn)2h非力竭性游泳后即刻脾淋巴細(xì)胞對ConA的反應(yīng)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)明顯增強(qiáng)。Machei報(bào)道,在不同強(qiáng)度和不同時(shí)間的運(yùn)動(dòng)中,運(yùn)動(dòng)后2h淋巴細(xì)胞對絲裂原ConA的應(yīng)答減弱,且減弱的程度與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加一致,運(yùn)動(dòng)后24h恢復(fù)到運(yùn)動(dòng)前水平[6],我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過度游泳訓(xùn)練會(huì)使小鼠脾淋巴細(xì)胞對ConA的應(yīng)答減弱,而45min游泳組能使小鼠脾細(xì)胞對ConA的應(yīng)答增強(qiáng),由此可說明適當(dāng)運(yùn)動(dòng)有利于機(jī)體T淋巴細(xì)胞功能的增強(qiáng)。

3.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對小鼠NK細(xì)胞比例的影響

NK細(xì)胞是一個(gè)具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的特殊淋巴細(xì)胞系,它對靶細(xì)胞的殺傷作用表現(xiàn)為一種速發(fā)性反應(yīng),無需預(yù)先致敏,能殺傷腫瘤細(xì)胞、病毒和被感染的細(xì)胞等,所以NK細(xì)胞在抗病毒感染等的第一線防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,是運(yùn)動(dòng)影響非特異性免疫機(jī)能的觀測指標(biāo)。SuzuiM等[7]對每天訓(xùn)練5h,6 days/wk為期10天大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的排球運(yùn)動(dòng)員研究表明,劇烈運(yùn)動(dòng)使NK細(xì)胞毒活性降低。金其貫等[8]表明,經(jīng)過8周游泳訓(xùn)練后的大鼠,1h訓(xùn)練組,NK細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組,而力竭組NK細(xì)胞顯著低于1h訓(xùn)練組和對照組。我們對小鼠進(jìn)行6周的游泳訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)力竭組NK細(xì)胞比例較45min游泳組和對照組明顯降低,45min游泳組NK細(xì)胞比例較對照組顯著升高,從而表明適當(dāng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以提高NK細(xì)胞數(shù)量,提高機(jī)體非特異性免役的功能,過度訓(xùn)練可以減少NK細(xì)胞,抑制機(jī)體的免疫功能。

3.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對小鼠脾T細(xì)胞亞群的影響

T淋巴細(xì)胞具有識別特異性抗原的能力,對體內(nèi)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)類型及強(qiáng)度都有重要的調(diào)節(jié)作用,成熟T淋巴細(xì)胞主要分為CD4和CD8兩個(gè)亞群,CD4淋巴細(xì)胞亞群包括TDTH細(xì)胞和TH細(xì)胞(誘導(dǎo)-輔助T淋巴細(xì)胞,以TH細(xì)胞為主),CD8淋巴細(xì)胞亞群包括TS(抑制性T細(xì)胞)和TC (殺傷性T細(xì)胞)細(xì)胞,CD4促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答,CD8能抑制免疫應(yīng)答過程,兩種作用相反的T淋巴細(xì)胞借助相互拮抗,調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答,所以兩者T細(xì)胞亞群比例失調(diào)就會(huì)產(chǎn)生機(jī)體免疫功能失常。本試驗(yàn)研究表明,過度訓(xùn)練對小鼠CD3、CD4細(xì)胞比例明顯低于對照組和45min訓(xùn)練組,CD8細(xì)胞比例高于對照組,CD4/CD8比值低于對照組和45min訓(xùn)練組。陳佩杰等[9]研究表明:運(yùn)動(dòng)員CD8構(gòu)成比正常人高,經(jīng)4周高強(qiáng)度大負(fù)荷的訓(xùn)練后,結(jié)果CD8比例更加升高。從理論上講,CD8比例上升會(huì)增加該細(xì)胞對機(jī)體免疫功能的抑制作用,導(dǎo)致CD4的免疫促進(jìn),過度劇烈的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂,作用相互減弱,我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與之相吻合,由此表明,大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練后,機(jī)體CD4/CD8比值呈下降趨勢,適當(dāng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練有利于比值上升。

大負(fù)荷或劇烈運(yùn)動(dòng)所致免疫功能下降的機(jī)制至今尚未十分清楚。劇烈運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致氧自由基增多攻擊免疫細(xì)胞膜,微量元素不足,谷氨酰胺、糖類等免疫細(xì)胞供能物質(zhì)缺乏,激素分泌紊亂,DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等可能是免疫功能下降的原因[10-13]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明:大負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致小鼠免疫功能下降,運(yùn)動(dòng)性免疫已經(jīng)發(fā)生,而適量運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了小鼠免疫功能,機(jī)體免疫功能的消長與有關(guān)免疫細(xì)胞的變化一致。這有助于解釋運(yùn)動(dòng)性免疫抑制發(fā)生機(jī)制,為尋求有效干預(yù)途徑、方法提供參考依據(jù)。

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Effect on Immunologic Function in M ice by Different Exercises

Xu Diqun1,2,Lin Ling1,Liang Huijuan1,Liu Fei1,Cao Fang1
(1.P.E.Department Zhangzhou Normal University,Zhangzhou,363000,Fujian China; 2.Departmentof Sports Science,Shanghai Sport University,Shanghai,200438,China)

The purpose of the researchwas to explore the effectof immunologic function and provide themeansof intervention.33male Balb/cmicewere divided into three groups randomly.The controled group(n=10)was sedentary.The 45min training group(n=10)and theovertraining group(n=13,3mice died during training)were forced to receive acclimatization training in the firstweek,then the 45min training group and the overtraining group were trained for 45min and to beexhausted per day respectively in the following 5weeks.Spleen lymphocyte cell’s transformationwas tested bymeansof3H-TdR.T lymphocyte subgroup and the activity of national killer cells(NK)were assessed bymeansof flow cytometry.Results:①after 6-week swimming training,lymphocyte proliferation and the numberof NK、CD3、CD4、CD4/CD8 in 45min training group were signficantly larger than that in controled group and overtraining group(P＜0.01).The numberof CD8 in 45min training group tended to increasewithout significant difference comparedwith controled group,but it decreased with significant difference compared with the overtraining group(P＜0.01).②Lymphocyte proliferation and the number of NK、CD3、CD4、CD4/ CD8 in the overtraining group were signficantly smaller than that in controled group and 45min training group(P＜0.05).However,the number of CD8 in theovertraining group was signficantly larger than the other two groups.It indicated that the overtrainingmight have caused the immune function decline, while reasonable exercisewould have strengthened and improved the immune function of anti-infection ability.

exercise;mice;immunologic function

G804.2

A

1672-1365(2011)01-0073-03

2010-06-04;

2010-08-09

福建省教育廳資助項(xiàng)目(JA07133S;JB06153);福建省大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(10xscxxsyxm29)。

許弟群(1974-),男,湖南邵陽人,碩士,講師,研究方向:運(yùn)動(dòng)免疫、營養(yǎng)與生化。