姚 虹,呂 治,蘇建榮

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心,北京100050)

有資料表明,在細菌性陰道炎的微生物菌群中陰道加德納菌(Gardnerella vaginalis,GV)處于優(yōu)勢地位,數(shù)量明顯高于其他非正常菌群[1]。目前對GV的實驗室診斷隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,PCR技術(shù)以快速,敏感和特異等優(yōu)點迅速地應用到臨床。PCR檢測細菌的關(guān)鍵之一是模板的選擇,即要確定擴增的目的基因。因此,簡單實用的細菌基因組DNA的提取是GV研究的基礎(chǔ)。本研究通過多種方法提取GV基因組DNA,然后通過定量檢測進行比較,建立一種簡單高效的細菌基因組DNA提取的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 GV株為衛(wèi)生部質(zhì)控株。

1.1.2 試劑 蛋白酶K,溶菌酶,SDS均是Sigma公司生產(chǎn)。

1.1.3 儀器 凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad Gel Doc 2000型,PCR儀為Biotronic公司AG-9600型,熒光定量PCR擴增儀為ABI7300。CO2培養(yǎng)箱為日本SANYO公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將菌株接種于人血瓊脂平板上,5%CO2,35℃培養(yǎng)24小時。挑取單個菌落接種于腦心浸出液液體培養(yǎng)基,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至2.0麥氏比濁單位。

1.2.2 細菌基因組DNA提取方法 ①酚-氯仿抽提法 1ml細菌過夜培養(yǎng)液,5 000 rpm離心10min,去上清液,加550μl TE懸浮沉淀,并加50μl 10%SDS,50μl 20 mg/ml蛋白酶 K,混勻,37℃保溫1 h。加 150μl 5mmol/L NaCl,混勻。加150μl CTAB/Na-Cl溶液,混勻,65℃保溫20 min。用等體積酚:氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提 ,5 000 rpm離心 10 min,將上清液移至干凈離心管中,用等體積酚∶氯仿(24∶1)抽提,取上清液移至干凈試管中,加1倍體積異丙醇,顛倒混合,室溫下靜止10分鐘,沉淀DNA,用70%乙醇漂洗沉淀后,洗干,溶解于100μl TE,-20℃保存[2]。②加熱煮沸法 取1 ml細菌過夜培養(yǎng)液,5 000 rpm離心10 min,去上清液,加100μl TE,100℃煮沸10 min,高速低溫離心10 min(4℃,12 000 r/min),取上清液-20℃保存[2]。

③溶菌酶-煮沸法 取1 ml細菌過夜培養(yǎng)液,5 000 rpm離心10 min,去上清液,加入溶菌酶100μl(10 mg/ml,1 g溶菌酶溶于10 mmol/LTris-HCL),100℃煮沸10 min,高速低溫離心10 min(4℃,12 000 r/min),取上清液-20℃保存[3]。

④堿裂解-煮沸法 取1 m細菌過夜培養(yǎng)液,5 000 rpm離心10min,去上清液,加100μl 0.2 mol/L NaOH,100℃煮沸10min,高速低溫離心10min(4℃,12 000 r/min),取上清液-20℃保存[4]。

⑤醋酸鉀法 取1 ml細菌過夜培養(yǎng)液 (麥氏比濁為2.0),5 000 rpm離心10 min,丟去上清液,收集菌體。加入400μl裂解液(40mM Tris-醋酸,20 mM醋酸鈉,1 mM EDTA,10%SDS,pH7.8)混勻,置于37℃水浴1 h。然后加入200μl 5mol/L的氯化鈉溶液,混勻后于高速低溫離心10min。取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。加兩倍體積無水乙醇,1/10體積醋酸鉀(3M,pH8.0),高速低溫離心10 min,棄上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室溫干燥后,溶于100μl TE溶液中,置4℃保存?zhèn)溆肹5]。

⑥改良溶菌酶-鹽析法 將1 ml細菌過夜培養(yǎng)液,5 000 rpm離心10 min,棄上清,加入400μl溶菌酶裂解液[1 g溶菌酶溶于5mmol/L NaCl,20mmol/L Tris2HCl,1mmol/L EDTA,8%蔗糖,20 mg/ml蛋白酶K混合液400μl],加入100μl 10%十二烷基硫酸鈉,置56℃水浴箱1 h;然后加入200μl 5 mol/L的氯化鈉溶液,混勻后于高速低溫離心10 min。取上清液,加兩倍體積無水乙醇沉淀DNA,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室溫干燥后,溶于100μl TE溶液中,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因組DNA純度和濃度測定 使用UV-24019C型紫外分光光度儀檢測基因組濃度及OD260/OD280值。

1.2.4 普通PCR對基因組DNA定性檢測 GV的引物合成參照文獻[6],由上海英俊生物公司合成。序列如下:P1,5’-GGGCGGGCTAGAGTGCA-3’;P2,5’-GAACCCGTGGAATGGGCC-3’,產(chǎn)物條帶大小為 332 bp。以 GV質(zhì)控株為模板,以 P1和 P2為引物,反應體系為 25μl:Taqmix 12.5μl,P1 1μl,P2 1μl,模板2 μl,dH2O 8.5μl。反應條件:95℃10 min,94℃30 S,62℃30 S,72℃30 S,40個循環(huán),72℃7 min。使用2%瓊脂糖凝膠進行產(chǎn)物檢測。

1.2.5 FQ-PCR測定 對6種方法提取的 GV基因組DNA作熒光定量PCR,引物同上。PCR反應體積為25μl,PCR參數(shù):94℃預變性 5 min,94℃45 s、55℃45 s、72℃1 min,35個循環(huán) ,最后 72℃5 min結(jié)束反應。根據(jù)Ct值對提取效率進行判斷。

2 結(jié)果

2.1 定性PCR測定結(jié)果 對6種方法提取的GV基因組DNA進行普通PCR,PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,均可見332 bp左右的特異性條帶,具體結(jié)果見圖1。

圖1 GV標準菌株瓊脂糖凝膠電泳

2.2 熒光定量PCR測定結(jié)果 對6種方法提取的GV基因組DNA作熒光定量PCR,從左到右,以改良法CT值最低,其次為酚-氯仿抽提法、醋酸鉀法、堿裂解煮沸法和溶菌酶煮沸法,加熱煮沸法CT值最高。具體結(jié)果見圖2。

圖2 FQ-PCR測定不同方法提取 GV基因組DNA

2.3 不同方法提取DNA的比較

通過多次平行試驗表明改良法提取效率最高,酚-氯仿抽提法和醋酸鉀法提取效率次之,堿裂解煮沸法和溶菌酶煮沸法提取效率較差,加熱煮沸法提取率最低。具體結(jié)果見表1。

表1 不同細菌基因組DNA提取方法的比較

3 討論

在臨床微生物檢驗中,常規(guī)分離方法是最基礎(chǔ)的,也是最廣泛的,但是傳統(tǒng)的細菌學檢驗于鑒定的主要依據(jù)是形態(tài)特征和生理性狀,需要進行細菌培養(yǎng)及一系列生化反應或免疫學檢測,方法復雜費時,對有些細菌也往往不能給出理想的鑒定結(jié)果[6]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,PCR技術(shù)以快速,敏感和特異等優(yōu)點迅速地應用到臨床微生物檢測領(lǐng)域。PCR檢測細菌的關(guān)鍵之一是模板的選擇,即要確定擴增的目的基因。因此,簡單實用的細菌基因組DNA的提取是分子生物學技術(shù)研究和檢測臨床細菌的基礎(chǔ)。

獲得一定濃度和純度的DNA是進行分子生物學研究的基礎(chǔ)。破解細胞壁與細胞膜是獲得基因組DNA的前提,而蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)的分離是獲得高質(zhì)量DNA產(chǎn)物的關(guān)鍵。目前,細菌基因組DNA提取方法有酚抽提法,專用DNA提取試劑盒法,堿裂解法,加熱煮沸法,溶菌酶裂解法,SDS裂解法,及其他破壁方法(超聲破碎,研磨破碎,反復凍融等)[7]。DNA經(jīng)典分離方法是酚/氯仿抽提法,該法雖然效率較高,但費時費力,而且其操作中要求多次離心,增加了樣品污染的可能性。在DNA溶液中的酚類等有機物質(zhì)對DNA聚合酶有抑制作用,特別是在PCR擴增過程中會對擴增過程產(chǎn)生抑制作用。由于采用有機溶劑的處理,試劑有一定的毒性,大量應用有害健康,不適合常規(guī)應用。加熱煮沸法時間短,操作簡單,但加熱過程中會有少部分DNA降解導致提取效率較低,同時其最大缺陷是無法提取革蘭氏陽性菌基因組DNA;堿裂解法是一種簡便的細菌基因組DNA提取方法,但該法提取采用強堿具有一定的腐蝕性;SDS裂解法及溶菌酶法一般需要復雜的裂解液體系并借助蛋白酶K和RNA酶的幫助來獲得高質(zhì)量的抽提產(chǎn)物,部分藥品及相關(guān)酶試劑價格昂貴[8]。DNA專用試劑盒提取法提取細菌基因組DNA效果好但成本較高,臨床應用受到限制。

本文對上述其中幾種提取細菌基因組DNA方法進行了對比實驗,研究結(jié)果證實了各種方法的優(yōu)缺點。加熱煮沸法操作簡單,但提取效率低。為縮短操作時間,本研究中將溶菌酶法和堿裂解法與煮沸法結(jié)合,堿裂解法提取效率要好于溶菌酶法。本實驗結(jié)果表明單獨使用溶菌酶不能達到良好的提取效果。酚氯仿提取法是經(jīng)典的提取方法,提取效率較好,但操作繁瑣,耗時長。雖然DNA得率高,但熒光定量PCR的CT值卻偏低,證實了可能有少量酚殘留對PCR擴增的抑制作用。醋酸鉀法是用SDS破壁,高鹽低 PH溶液沉淀蛋白質(zhì),用酚氯仿抽提,提取效率稍差。本實驗改良法中我們將溶菌酶法和鹽析法結(jié)合并進行了改良,一次同時加入溶菌酶消化,蛋白酶K降解蛋白,SDS充分裂解細胞并去除有機雜質(zhì),然后用飽和氯化鈉沉淀蛋白質(zhì),并經(jīng)離心除去,上清直接用乙醇沉淀DNA。該法簡化了DNA的抽提步驟,減少了有機溶劑的使用,提取的DNA具有較高的濃度和純度,適合臨床應用,建議各實驗室可根據(jù)具體要求來合理地選用DNA的提取方法及試劑。

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