北京市朝陽(yáng)區(qū)藥品檢驗(yàn)所（100028）張艷霞

中國(guó)食品藥品檢定研究院（100050）孫磊

《中國(guó)藥典》2010年版二部已經(jīng)收載紫杉醇原料藥及制劑的HPLC有關(guān)物質(zhì)檢查法[1][2]。由于藥典和相關(guān)文獻(xiàn)[3][4]的色譜條件梯度變化較劇烈，造成紫杉醇主峰流出后的色譜圖基線波動(dòng)較大，影響其后雜質(zhì)峰的檢出和定量，因此筆者優(yōu)化了色譜條件，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，分析時(shí)間稍延長(zhǎng)，但提供了更好的分離和識(shí)別效果。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀（2487紫外檢測(cè)器，Epower2工作站），島津2010a高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，CLASSVP工作站），紫杉醇、三杉尖寧堿（雜質(zhì)Ⅰ）和7-表-10-去乙?；仙即迹s質(zhì)Ⅱ）對(duì)照品均為USP reference standard，乙腈（色譜純，F(xiàn)isher），實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q系統(tǒng)制備，紫杉醇注射液。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Alltech C18 (250 m m×4.6 m m×5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)227nm；柱溫35℃；流速1.2ml·min-1。乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序如下：

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取紫杉醇、雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌愤m量，用乙腈溶解并稀釋制成每1ml含紫杉醇1.2mg、雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ各6μg的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。取該溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量15μl，理論板數(shù)按紫杉醇峰計(jì)應(yīng)不低于25000，紫杉醇峰與雜質(zhì)Ⅱ峰的分離度應(yīng)不低于1.2，雜質(zhì)Ⅱ峰面積的RSD應(yīng)不大于2.0%。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液 精密量取注射液2ml置10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

附表 梯度洗脫程序

2.3.2 對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液0.5ml置100ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 賦形劑溶液 精密量取賦形劑2ml置10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照溶液、供試品溶液和賦性劑溶液各15μl分別注入色譜儀，記錄色譜圖，60分鐘前所記錄的色譜圖中，扣除賦形劑溶液中的色譜峰，雜質(zhì)Ⅰ（雜質(zhì)Ⅰ峰面積乘以校正因子1.26）與其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積均不得大于對(duì)照溶液主峰面積（0.5%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的4倍（2.0%），見(jiàn)附圖。

2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 對(duì)紫杉醇注射液進(jìn)行酸液（0.1mol/LHCl）、堿液（0.1mol/LNaOH）、氧化（3%H2O2）、高溫（80℃水浴加熱4.5小時(shí)）、光照（日光下直射30分鐘）等破壞試驗(yàn)并用上述色譜條件檢查，結(jié)果表明光破壞、熱破壞、氧化破壞后的樣品未產(chǎn)生新雜質(zhì)，酸和堿破壞的樣品產(chǎn)生新雜質(zhì)，各雜質(zhì)峰分離均良好。

2.6 線性范圍、檢出限和定量限 精密稱(chēng)取紫杉醇對(duì)照品6.06mg，置入10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取該溶液配制成一系列濃度的7份溶液，每份溶液進(jìn)樣2次，進(jìn)樣量15μl。以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=1983.632x-5659.408，r=0.9997，表明紫杉醇在1.212～454.5ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

以信噪比S/N≈3，測(cè)得紫杉醇檢出限為40ng·ml-1；以信噪比S/N≈10，測(cè)得紫杉醇定量限80ng·ml-1。

2.7 穩(wěn)定性和重復(fù)性 照供試品溶液制備法制備溶液1份，取該溶液分別在0h、5h、12h、16h和24h測(cè)定，進(jìn)樣量15μl，各雜質(zhì)峰面積RSD均小于2%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好；照供試品溶液制備法制備溶液6份，取6份溶液各進(jìn)樣2次，進(jìn)樣量15μl，各雜質(zhì)峰面積RSD均小于2.5%，表明重復(fù)性良好。

3 討論

流速考察 將流速降低到1.1ml·min-1，其他條件不變，有雜質(zhì)峰消失；將流速升高到1.3ml·min-1，其他條件不變，雜質(zhì)峰的數(shù)目和分離效果與原先基本一致。因此，流速應(yīng)在1.2ml·min-1～1.3ml·min-1。

柱溫考察 將柱溫降至30℃，其他條件不變，有2個(gè)雜質(zhì)峰消失；將柱溫升至40℃，其他條件不變，雜質(zhì)峰的數(shù)目與原先基本一致，個(gè)別峰分離度更好。因此，柱溫應(yīng)在35℃～40℃。

pH值耐用性 將pH值降低0.2單位，其他條件不變，雜質(zhì)峰的數(shù)目和分離效果與原先基本一致；將pH值升高0.2單位，其他條件不變，雜質(zhì)峰的數(shù)目和分離效果與原先基本一致。因此該方法能夠耐受較小的pH值變化。

色譜柱耐用性 另采用AKZO NOBEL Kromosil 100 C18色譜柱及迪馬鉆石C18色譜柱（均為250 mm×4.6mm×5μm）對(duì)同一樣品進(jìn)行了測(cè)定，色譜圖基本一致，表明該法對(duì)色譜柱的耐用性較好。