閆 燕，許文濤，蘇春元，羅云波，王一南，谷新晰，戴蘊(yùn)青，田洪濤，*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083; 3.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京100083)

平菇基因組DNA提取方法的研究

閆 燕1，2，3，許文濤2，3，蘇春元2，羅云波2，王一南3，谷新晰1，戴蘊(yùn)青2，3，田洪濤1，*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083; 3.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京100083)

以實(shí)驗(yàn)室自行培育的平菇為實(shí)驗(yàn)材料，分別使用CTAB法、SDS-CTAB法以及高鹽酶解法提取平菇基因組DNA，并通過紫外分光光度計(jì)、限制性酶切及PCR檢測(cè)來衡量基因組質(zhì)量。結(jié)果表明，使用CTAB法很難得到高質(zhì)量的基因組DNA，OD260/280僅為1.5左右，而且伴有較多的雜質(zhì)，電泳條帶拖尾嚴(yán)重;使用EcoRI限制性酶對(duì)其進(jìn)行酶切分析，效率較低，同時(shí)PCR檢測(cè)不能得到有效擴(kuò)增;而使用優(yōu)化后的SDS-CTAB法及高鹽酶解法提取平菇DNA，能夠獲得質(zhì)量高、純度好的基因組DNA，OD260/280基本保持在1.8～2.0之間，電泳條帶較為清晰均一，使用EcoRI限制性酶對(duì)其進(jìn)行酶切分析，酶切效果較好，并且DNA質(zhì)量能夠滿足PCR檢測(cè)的模板要求。說明SDS-CTAB法以及高鹽酶解法提取的平菇DNA能夠滿足分子水平操作的要求，兩者相比，前者成本較低，后者產(chǎn)率較高。

平菇，基因組DNA，提取方法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平菇 實(shí)驗(yàn)室自行培育、分離，研究部分為菌皮、菌肉、菌褶以及菌柄四部分，分別標(biāo)記為1、2、3、4號(hào);DL2000 DNA marker(300ng/5μL) 大連寶生物工程有限公司;RNase、溶壁酶(500U/mL)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)、各10mmol/L的四種脫氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)混合液 購自Sigma (美國)公司;CTAB緩沖液，100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，6mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，20g/L CTAB，苯酚/氯仿溶液1∶1(v/v)，10×PCR Buffer，100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，0.2%β-巰基乙醇(v/v)，2%SDS緩沖液，蛋白酶K(20mg/mL)，1×TE緩沖液，1mol/L Tris-HCl (pH8.0)100mL，500mmol/L EDTA(pH8.0)20mL;其它試劑或溶劑 均為分析純或生化純。

電熱恒溫水浴鍋HH-SY2HUI 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司;ASP-3700型紫外分光光度計(jì) 美國ACTGene公司;電子天平FA100413 上海越平科學(xué)儀器有限公司;電泳儀 北京市六一廠;PHX型智能生化培養(yǎng)箱 寧波萊?？萍加邢薰?PCR儀 BIO -RAD ALD-1244;紫外投射儀GelDoc-It PN 95-0441-02 ENFO-980179振蕩搖床。

1.2 DNA的提取方法

1.2.1 CTAB法 摘取平菇菌蓋、菌肉、菌褶及菌柄四部分，加入少許液氮進(jìn)行研磨，分別稱取大約200mg樣品，加入800μL預(yù)熱到65℃的CTAB提取液，充分振蕩，放入65℃水浴鍋中1～2h。取出EP管，于4℃，12000r/min離心10min。吸取1mL上清液移入新管中，加入等體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻，于 4℃，12000r/min離心10min。吸取上清液移入新管中，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)。小心倒掉上清液，加入2/3體積的異丙醇，混勻后，置于-20℃下放置30min。取出樣品，于4℃，12000r/min離心10min，倒掉上清液后，加入700μL 70%乙醇，用槍頭吹吸，使沉淀重懸于乙醇中，于4℃，12000r/min離心10min，小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，控干上清液，置于超凈工作臺(tái)上吹干10～15min。晾干后，加入50μL提前在水浴鍋中預(yù)熱的滅菌水，使沉淀充分溶解，加入2μL RNase放置于37℃水浴鍋中消化30min，即為所得DNA提取液。

1.2.2 SDS-CTAB提取法 摘取新鮮的平菇菌蓋、菌肉、菌褶及菌柄四部分，加入少量海砂，進(jìn)行液氮研磨，取2.0mL EP管提前放入液氮遇冷，分別稱取大約200mg樣品，迅速加入 600μL預(yù)熱到 65℃的CTAB提取液，充分重懸沉淀，放入65℃搖床中1h，1200r/min。取出樣品，加入400μL SDS提取液和3μL蛋白酶K，充分混勻并放回?fù)u床中。取出 EP管，于4℃，12000r/min離心10min。吸取1mL上清液移入新管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，于4℃，12000r/min離心10min。吸取上清液移入新管中，重復(fù)前一步操作。小心倒掉上清液，加入2/3體積的異丙醇，混勻后，置于-20℃下放置30min。取出樣品，于4℃，12000r/min離心10min，倒掉上清液后，加入700μL 70%乙醇，用槍頭吹吸，使沉淀重懸于乙醇中，于4℃，12000r/min離心10min，小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上控干上清液，置于超凈工作臺(tái)上吹干10～15min。晾干后，加入50μL提前在水浴鍋中預(yù)熱的滅菌水，使沉淀充分溶解，加入2μL RNase放置于37℃水浴鍋中消化30min，即為所得DNA提取液。

1.2.3 高鹽酶解法 摘取平菇菌蓋、菌肉、菌褶及菌柄四部分，加入少量海砂，進(jìn)行液氮研磨，稱取大約200mg樣品，加入400μL TE緩沖液，充分振蕩。向每支樣品加入2μL溶壁酶，顛倒混勻，放入搖床30℃，1200r/min，1h。取出樣品，于4℃，12000r/min離心10min，小心將上清液移入新管中，加入400μL CTAB提取液充分混勻，放入搖床中65℃，1200r/min，30min。取出樣品向其中加入200μL SDS提取液和3μL蛋白酶K，放回?fù)u床中65℃，1200r/min，30min。取出樣品，于4℃，12000r/min離心10min，吸取1mL上清液移入新管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，于4℃，12000r/min離心10min。吸取上清液移入新管中，重復(fù)上述抽提一次，吸出上清液，加入600μL異丙醇，1/5體積的醋酸鉀，混勻后，置于-20℃放置下20min。取出樣品，于4℃，12000r/min離心 10min，小心倒掉上清液，加入700μL 70%乙醇，用槍頭吹吸，使沉淀重懸于乙醇中，于4℃，12000r/min離心10min，小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上晾干上清液，置于超凈工作臺(tái)上吹干10～15min。晾干后，加入50μL提前在水浴鍋中預(yù)熱的滅菌水，使沉淀充分溶解，加入2μL RNase放置于37℃水浴鍋中消化30min，即為所得DNA提取液。

1.3 平菇基因組DNA的電泳檢測(cè)及純度分析

基因組DNA提取后，用1×TAE溶液配制1%的瓊脂糖液，加入0.5μg/mL的EB，制成瓊脂糖凝膠。取2μL DNA溶液與0.5μL點(diǎn)樣緩沖液混合后點(diǎn)樣。隨后在120V恒定電壓條件下進(jìn)行電泳，時(shí)間約為20min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外投射儀上成像，分析電泳結(jié)果。

取提取后的平菇DNA溶液2μL，用ASP-3700型紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm下的紫外吸收值及所提取樣品的濃度。

1.4 平菇基因組DNA的酶切分析

在0.5mL離心管中依次加入3μg平菇DNA，2μL 10×Buffer，0.5μL EcoRI(10U/μL)以及2μL乙酰BSA(10μg/μL)，加無菌ddH2O至終體積20μL，瞬時(shí)離心后在37℃水浴鍋中溫育4h。用1%瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳(120V恒壓電泳20min)，電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外投射儀上成像，分析酶切結(jié)果。

1.5 PCR檢測(cè)

對(duì)所提基因組DNA，選用18sRNA作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。引 物 序 列 為 Primer - F 5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3'，Primer-R5'-CGTGCTAGGATTGGGTAAT-3'(上海生工生物工程有限公司合成)。PCR反應(yīng)的總體積為30μL，其中，10×PCR buffer 3μL，dNTP 2.4μL，Primer-F 1.5μL，Primer-R 1.5μL，Taq酶0.2μL，模板2μL(約50ng)。擴(kuò)增條件:95℃3min，95℃15s，58℃5min，72℃10min，35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)儀器為ABi2700 thermal cycle。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的純度及濃度

3種方法提取的DNA質(zhì)量結(jié)果見表1～表3和圖1，圖表中編號(hào)A、B、C分別表示CTAB法、SDSCTAB法以及高鹽酶解法，1～4分別表示平菇的菌皮、菌肉、菌褶、菌柄四個(gè)部位。紫外分光光度計(jì)測(cè)定的260nm和280nm下的紫外吸收值分別代表了鹽濃度、核酸、蛋白質(zhì)等有機(jī)物的吸光度值。高質(zhì)量的DNAOD260/280應(yīng)在 1.8～2.0之間，當(dāng) OD260/280小于 1.8時(shí)，DNA中存在蛋白質(zhì)的污染，當(dāng) OD260/280大于2.0時(shí)，DNA提取物中RNA含量較高。從表中數(shù)據(jù)分析得出，在方法B、C中OD260/280基本保持在1.8～2.0之間，說明SDS-CTAB法以及高鹽酶解法所提取的DNA質(zhì)量較好;CTAB法中OD260/280值低于1.8，說明溶液中的蛋白質(zhì)等有機(jī)物的污染比較明顯。

表1 CTAB法

表2 SDS-CTAB法

表3 高鹽酶解法

2.2 DNA分子的完整性

DNA電泳結(jié)果表明(圖1)，CTAB法提取的DNA量較少，而且存在嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，并且有斷裂DNA干擾，經(jīng)RNase消化后，仍有很多RNA殘留。使用SDS-CTAB提取的平菇各組織DNA產(chǎn)率相對(duì)較高，電泳條帶無拖尾，經(jīng)RNase酶消化后，僅殘留少量的RNA。與上述兩種方法相比，高鹽酶解法提取的平菇各組織DNA產(chǎn)率最高，而且電泳條帶均一。其次，通過比較可以看出，經(jīng)過相同時(shí)間的RNase消化，CTAB法提取的平菇基因組 DNA中RNA殘留量最多，若要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，需延長(zhǎng)RNase酶的消化時(shí)間。

圖1 三種方法提取平菇基因組DNA的電泳圖譜

2.3 平菇基因組DNA的酶切鑒定

對(duì)使用CTAB法(A1～A4)、SDS-CTAB法(B1～B4)以及高鹽酶解法(C1～C4)提取的平菇DNA進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物的電泳圖譜如圖2所示?？梢钥闯?，CTAB法所提取的平菇DNA條帶有拖尾現(xiàn)象，很難被EcoRI酶切;而SDS-CTAB法、高鹽酶解法所提取的平菇DNA樣品都能被EcoRI酶切，酶切圖譜呈彌散狀，說明高質(zhì)量的基因組DNA雜質(zhì)很少，而且其鹽濃度不會(huì)抑制限制性內(nèi)切酶的活性，而質(zhì)量較差的基因組DNA限制性內(nèi)切酶的酶切效率很低，這兩種方法提取的基因組DNA純度較好，可以滿足酶切等分子生物實(shí)驗(yàn)的要求。

圖2 三種方法提取的基因組EcoRI酶切圖譜

2.4 平菇基因組的PCR擴(kuò)增分析

以CTAB法、SDS-CTAB法以及高鹽酶解法提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖3所示。以CTAB方法提取的基因組作為模板，如A1～A4所示，電泳條帶模糊，甚至不能得到有效擴(kuò)增，很可能是由于RNA、多糖、多酚等雜質(zhì)的存在，從而影響了基因組DNA的純度，抑制了PCR反應(yīng)的進(jìn)行;而以SDS-CTAB法、高鹽酶解法所提取的平菇組織DNA為模板擴(kuò)增的目的條帶清晰、整齊，擴(kuò)增效率高。結(jié)果表明，SDS-CTAB法、高鹽酶解法兩種優(yōu)化方法能夠有效地提取高質(zhì)量的平菇基因組DNA，并且可以滿足相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。

圖3 PCR擴(kuò)增圖譜

3 討論

為獲得高質(zhì)量、高純度的DNA基因組，本實(shí)驗(yàn)選擇了平菇的菌皮、菌肉、菌褶、菌柄分別進(jìn)行提取。菌褶中含有大量的擔(dān)子，是有性繁殖的重要途徑，因此也是細(xì)胞含量較豐富的組織，并且相對(duì)菌肉來說取材容易，是提取子實(shí)體基因組的首選位置。平菇菌皮由于紫外線的照射通常大部分呈灰色，含有較多的酚類物質(zhì)。Katterman，F(xiàn).R.H和 Shattuck，V.l. An［5］曾報(bào)道由于光照強(qiáng)度的影響，野生型菌比溫室培養(yǎng)菌含有更高的單寧酸以及多酚復(fù)合物。因此提取菌褶時(shí)，會(huì)出現(xiàn)大量的蛋白雜質(zhì)，從而很可能影響DNA的質(zhì)量。菌柄由于較為嚴(yán)重的木質(zhì)化、纖維化，細(xì)胞組織老化、變形，增加了提取的難度，因此只能獲得較為有限的基因組DNA，而以這部分組織的基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖3中A4所示，不能得到有效擴(kuò)增。其次，老化組織比幼齡組織包含更多的多酚、萜類物質(zhì)［6］，這類物質(zhì)通常為灰色，在研磨時(shí)從液泡中釋放出來，不可避免地與DNA結(jié)合，在后續(xù)工作中很可能成為影響模板DNA質(zhì)量的因素。因此，取材時(shí)應(yīng)選用新鮮幼齡樣品作為研究對(duì)象。

通過已有文獻(xiàn)報(bào)道的平菇DNA提取實(shí)驗(yàn)方法，我們可以總結(jié)出以下幾處共同點(diǎn):首先，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，如用液氮對(duì)組織研磨［7-8］，對(duì)菌絲進(jìn)行凍干處理，加入玻璃珠或其它具有破壞性的微小顆粒進(jìn)行細(xì)胞研磨［9］，加入裂解液進(jìn)行劇烈振蕩等［10］，使用緩沖液對(duì)DNA進(jìn)行抽提，并且對(duì)DNA進(jìn)行純化［11］。而這些方法的不同之處在于提取DNA所需時(shí)間，最終提取DNA的純度、含量以及所用的抽提試劑等方面。針對(duì)眾多的提取方法，我們嘗試使用CTAB提取方法，加入β-巰基乙醇和PVP［7］等進(jìn)行提取，得到基因組是粘性很強(qiáng)的灰褐色提取物，不能滿足PCR等后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模板DNA質(zhì)量要求。

如何獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)率的基因組DNA取決于細(xì)胞破碎是否徹底［12］，而平菇細(xì)胞壁較厚，需要特殊的處理才能使基因組有效釋放。在樣品前處理時(shí)加入海砂，增加了樣品之間的摩擦，使得液氮研磨的更加充分、快捷，從而縮短了樣品在外界的暴露時(shí)間，降低了交叉污染率，也可有效抑制胞內(nèi)酶對(duì)核酸的降解作用。

在裂解過程中，通過均質(zhì)化使得樣品充分混勻，減少了傳統(tǒng)方法中水浴鍋使用時(shí)進(jìn)行振蕩帶來的不便。由于裂解液中加入高濃度的CTAB與SDS，可有效地與酸性多糖相結(jié)合形成復(fù)合物，并且蛋白酶K在SDS存在的情況下能有效地與蛋白結(jié)合，減少蛋白等抑制因子的存在，加入高鹽成分，能有效地在抽提過程中減少多糖、多酚物質(zhì)的污染。Sangwan等曾報(bào)道使用氯仿∶異戊醇(24∶1)代替酚仿抽提，原因在于后者獲得的基因組質(zhì)量較差，酚污染嚴(yán)重［13］。正如SDS-CTAB法使用氯仿∶異戊醇(24∶1)獲得了較純的基因組DNA，并且減少了飽和酚在PCR反應(yīng)中的抑制作用，從而利用異丙醇沉淀基因組DNA。

但由于平菇屬于高等真菌，細(xì)胞壁中主要以幾丁質(zhì)構(gòu)成其骨架結(jié)構(gòu)，與細(xì)菌、植物都有很大差異，對(duì)于傳統(tǒng)的提取方法很難使得細(xì)胞內(nèi)含物有效釋放，因此，方法B在裂解前加入溶壁酶進(jìn)行酶解，從而有效破碎細(xì)胞壁，使得內(nèi)含物充分釋放，獲得高產(chǎn)率的基因組DNA。另外，高濃度的NaCl與醋酸鉀能獲得較高的產(chǎn)率，Jobes［14］等人就采用過這個(gè)方法。

綜上所述，本文中SDS-CTAB法、高鹽酶解法成功提取出質(zhì)量較好、純度較高的平菇子實(shí)體基因組DNA，兩種方法相比，前者成本較低，后者產(chǎn)率較高，用這兩類方法提取的平菇基因組DNA為菌種鑒定、基因分型等方面提供了可靠的保證，同時(shí)對(duì)于真菌基因組的提取起到很大輔助作用，也為今后進(jìn)一步開展高等真菌分子生物學(xué)方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Study on the methods of extraction of Pleurotus ostreatus genomic DNA

YAN Yan1，2，3，XU Wen-tao2，3，SU Chun-yuan2，LUO Yun-bo2，WANG Yi-nan3，GU Xin-xi1，DAI Yun-qing2，3，TIAN Hong-tao1，*
(1.Agricultural University of Hebei，College of Food Technology，Baoding 071001，China; 2.China Agricultural University，College of Food Science and Nutrition Engineering，Beijing 100083，China; 3.Supervision and Testing Center for GMOs Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

Pleurotus ostreatus(culture by ourselves)genomic DNA were extracted by three methods，which were the methods of CTAB method，SDS-CTAB method，and high-concentration salt precipitation method，respectively，analyzed by ultraviolet spectrophotometer，digested by restriction enzymes of EcoRI and PCR amplified.The results proved Pleurotus ostreatus genomic DNA was really difficult to isolated genomic DNA by CTAB method，the ratio of OD260/280was only 1.5，digested by EcoRI inefficiency and PCR amplification useless.The other two methods were proved efficiently，the ratio of OD260/280was between 1.8～2.0 and had a clear fragment through agarose gel electrophoresis，digested by EcoRI efficiency and could be used as template for PCR amplification analysis，while the effect of extract genomic DNA by SDS-CTAB purification method and high-concentration salt enzymolysis method could be used for downstream analyses，the former was lower cost and the latter was more efficiency.

Pleurotus ostreatus;genomic DNA;extraction methods

TS255.1

A

1002-0306(2011)09-0190-04

平菇(Pleurotus ostreatus)又名糙皮側(cè)耳，屬于絲狀真菌，是真菌植物門的子實(shí)體，它是一種高蛋白，富含多種維生素以及多糖成分的高級(jí)食品，在食品保健、醫(yī)療衛(wèi)生、生物化工等方面起著很重要的作用［1］。針對(duì)平菇的這些應(yīng)用，通常利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行研究，如基因的組成、基因的表達(dá)等?；蚪M提取是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)性研究，高效、穩(wěn)定的基因組提取方法不僅可以減少工作量，并且能縮短鑒定、檢測(cè)周期，給實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供可靠的幫助。目前已報(bào)道的平菇基因組提取方法中較為普遍應(yīng)用的是CTAB法(溴代十六烷基三甲胺)，即在帶有培養(yǎng)基的情況下對(duì)絲狀菌絲提取基因組，而培養(yǎng)基中帶有大量的糖、瓊脂等物質(zhì)給實(shí)驗(yàn)帶來了很大的不便［2］。此外，平菇不同生長(zhǎng)階段，所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物不同［3］，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，要對(duì)平菇子實(shí)體DNA進(jìn)行研究，但平菇這類高等真菌存在較厚的細(xì)胞壁或膠囊狀物質(zhì)，不利于裂解細(xì)胞釋放DNA［4］，并且由于大量的粘性多糖以及多酚類物質(zhì)的存在，因此CTAB法很難得到高質(zhì)量、高純度的DNA分子。本研究以優(yōu)化的基因組提取方法和傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，旨在探討高效、穩(wěn)定提取平菇子實(shí)體各部分基因組DNA的方法，從而為優(yōu)化高等真菌基因組的提取方法提供了有力參考，同時(shí)也為今后進(jìn)一步開展食用菌分子生物學(xué)研究以及檢疫檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

2010-12-08 *通訊聯(lián)系人

閆燕(1986-)，女，碩士研究生，研究方向:微生物酶資源開發(fā)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2006AA10Z440);國家自然基金 (30800770);轉(zhuǎn)基因生物重大專項(xiàng)(2008ZX08012-001)。