晁若瑜，楊靖亞，2，*，蔡曉曄，陸曉帆，錢媛華

(1.上海海洋大學(xué)，上海201306;2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海201306)

蘆根多糖的分離純化和體外抗腫瘤研究

晁若瑜1，楊靖亞1，2，*，蔡曉曄1，陸曉帆1，錢媛華1

(1.上海海洋大學(xué)，上海201306;2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海201306)

從蘆根中提取和純化了蘆根多糖，并研究其體外抗腫瘤活性。采用熱水浸提法從蘆根中提取蘆根多糖，經(jīng)Sevag法脫蛋白，冷凍干燥后，葡聚糖凝膠柱層析分離純化，得到純化的蘆根多糖，苯酚－硫酸法測(cè)定多糖樣品中總糖含量，凝膠層析測(cè)定多糖分子量，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究其體外抗腫瘤作用。結(jié)果測(cè)得蘆根多糖樣品中總糖含量為0.872%，分離純化得到三種蘆根多糖組分R－PolyⅠ、R－PolyⅡ、R－PolyⅢ，三者的分子量分別為79781、29073、10605u，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明三種蘆根多糖組分對(duì)Hela細(xì)胞和B16細(xì)胞均具有良好的抑制作用。這為蘆根多糖在食品工業(yè)及醫(yī)藥保健等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

蘆根多糖，提取，純化，抗腫瘤

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆根 購(gòu)于北京永安堂藥店，產(chǎn)地河北; SephadexG－100 美國(guó)Sigma公司;Dextran－T－10、T－40、T－70、T－100 瑞典Pharmacia公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清 Gibco公司;MTT 購(gòu)于上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司;無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、95%乙醇、苯酚、濃硫酸 均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥。

微波爐 WP700IP17，美的;雙列四孔恒溫水浴鍋 HWS－24，上?；厶﹥x器制造有限公司;低速自動(dòng)平衡離心機(jī) TDZ4A－WS，上海滬湘儀離心機(jī)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE－52A、恒流泵BF－100上海青浦滬西儀器廠;循環(huán)水多用真空泵SHZ－3、層析柱(1.6×40cm) 上海滬西分析儀器廠有限公司; 721紫外分光光度計(jì) 上海越平科學(xué)儀器有限公司; CO2培養(yǎng)箱NAPC06500 法國(guó)JOUAN公司;酶標(biāo)儀Model－680，Bio－Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆根多糖的提取 稱取干燥蘆根150g，0.5% NaHCO3溶液50℃水浴浸泡24h，室溫下，以蒸餾水洗凈蘆根。首先以料水比1∶3，大火(700W)微波提取8min，再在120℃，磁力攪拌條件下熱水浸提3h，抽濾，濾液進(jìn)行減壓濃縮后，攪拌下加入950mL/L乙醇，調(diào)醇含量至650mL/L，4℃靜置過夜，離心10min (3000r/min)，棄去上清液，沉淀先后用丙酮、無(wú)水乙醇洗2次，真空干燥揮去有機(jī)溶劑即得蘆根多糖的粗品［5］。

將蘆根多糖粗品用去離子水溶解轉(zhuǎn)移至100mL燒杯中，以Sevag法去除蛋白質(zhì)，加入氯仿－正丁醇(4∶1)溶液，振蕩10min，于分液漏斗萃取，保留上層萃取液，該操作重復(fù)2次。萃取液進(jìn)行減壓濃縮后，攪拌下加入950mL/L乙醇，調(diào)醇含量至650mL/L，4℃靜置過夜，離心10min(3000r/min)，棄去上清液，沉淀先后用丙酮、無(wú)水乙醇洗2次，真空干燥，即得蘆根粗多糖［6］。

1.2.2 蘆根多糖的含量測(cè)定

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取充分干燥至恒重的10mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加去離子水溶解，配制100mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1g/L。分別吸取配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL，分別加去離子水至2mL，加入5%的苯酚溶液1mL，搖勻后迅速加入5mL濃硫酸顯色，振蕩5min，在沸水浴上加熱15min，取出后于冷水浴中冷卻30min。以空白為參比，用紫外分光光度計(jì)在490nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.2.2 蘆根多糖的含量測(cè)定 取蘆根多糖100.0mg置于100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取0.25、0.5、1.0mL分別置于10mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。精密吸取上述溶液各1.0mL，按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，測(cè)定吸收度。

1.2.3 蘆根多糖的分離純化 選取1.6cm×40cm凝膠層析柱，有效長(zhǎng)度為35cm，床體積為80mL。以0.1mol/L NaCl溶液對(duì)Sephadex G－100凝膠進(jìn)行預(yù)處理。將冷凍干燥好的蘆根多糖溶于0.1mol/L NaCl溶液中，制成50mg/mL的蘆根多糖溶液。準(zhǔn)確吸取該溶液1.5mL上樣，以0.1mol/L NaCl溶液洗脫，調(diào)節(jié)流速，每6min收集一管，每管3mL［7］。硫酸－苯酚法逐管檢查各管洗脫液的吸光度，得三種多糖組分，見圖1，分別命名為R－PolyⅠ、R－PolyⅡ、R－PolyⅢ。收集糖反應(yīng)陽(yáng)性高峰，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，經(jīng)乙醇沉淀，靜置過夜后用無(wú)水乙醇及丙酮洗滌，冷凍干燥。

1.2.4 蘆根多糖的分子量測(cè)定 用Sephadex G－100 (1.6×40cm)測(cè)定蘆根多糖分子量，取T－10、T－40、T－70、T－100的標(biāo)準(zhǔn)多糖各100mg溶解后上柱，以0.1mol/L NaCl溶液洗脫，調(diào)節(jié)流速，每6min收集一管，每管3mL。硫酸－苯酚法跟蹤檢測(cè)，測(cè)出洗脫體積Ve，另以相對(duì)分子量200萬(wàn)的藍(lán)色葡聚糖上柱，得外水體積V0，以Ve/V0為橫坐標(biāo)，以相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以同樣的條件將蘆根多糖上柱，測(cè)定洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相對(duì)分子量［8］。

1.2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) Hela細(xì)胞及B16細(xì)胞為華東理工大學(xué)藥學(xué)院提供，用含 10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基傳代、培養(yǎng)。

分別接種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的Hela細(xì)胞和B16細(xì)胞的細(xì)胞懸液于96孔板中，每孔100μL，細(xì)胞數(shù)為1× 104個(gè)/孔，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。藥物組每孔加100mL的不同濃度(2、4、8、10mg/mL)的三種多糖液，對(duì)照組加100μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后每孔加入5mg/mL MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清，每孔加入100μL二甲基亞砜，震蕩10min后用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定其OD值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

抑制率(%)=(1－多糖組OD/對(duì)照組OD) ×100%［9］

圖1 蘆根多糖洗脫曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆根多糖的理化性質(zhì)

蘆根多糖為白色粉末，無(wú)臭、無(wú)味，溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，水溶液為透明或淡黃色。苯酚－硫酸法檢測(cè)呈陽(yáng)性。

2.2 蘆根多糖的含量

繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，其線性回歸方程為y=18.412x－0.0009(r=0.9995)。測(cè)得蘆根多糖的吸光度分別為0.391、0.847、1.552。根據(jù)回歸方程求出多糖含量分別為851.4、921.0、843.4mg/g，平均含量為871.9mg/g。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 蘆根多糖的分離純化

蘆根多糖經(jīng)凝膠柱層析，硫酸－苯酚法測(cè)定洗脫液的吸光度后得到三種多糖組分，見圖1，分別命名為R－PolyⅠ、R－PolyⅡ、R－PolyⅢ。收集三種多糖的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，乙醇沉淀，靜置過夜后用無(wú)水乙醇及丙酮洗滌，冷凍干燥。

2.4 蘆根多糖的分子量

四種標(biāo)準(zhǔn)多糖T－10、T－40、T－70、T－100的洗脫地指導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)，同時(shí)也為相似類型產(chǎn)品的保藏提供參考。

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Extraction，purification and anti－tumor activity of Reed Rhizome polysaccharide

CHAO Ruo－yu1，YANG Jing－ya1，2，*，CAI Xiao－ye1，LU Xiao－fan1，QIAN Yuan－h(huán)ua1
(1.Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China; (2.Institute of Marine Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

The polysaccharide was extracted from Reed Rhizome，the technology of its isolation，purification and anti－tumor activity were also studied.The polysaccharide was obtained through hot water extraction，then protein was removed by means of Sevag methods and purified by Sephadex chromatography.And the vitro anti－tumor activities were analyzed with cytotoxicity.The results showed that the saccharide content of the sample was 0.872%. Three kinds of polysaccharide(R－PolyⅠ，R－PolyⅡ，R－PolyⅢ)were obtained through the isolation and purification procedure，with their molecular weight estimated as 79781，29073，10605u respectively.Besides，the three polysaccharides displayed a noticeable inhibition effect in Hela and B16 cells.It laid the foundation for the wide application of the R－Poly in such fields as food industry and health care.

Reed Rhizome polysaccharide;extraction;purification;anti－tumor

TS201.2+3

B

1002－0306(2011)12－0284－03

蘆根(Reed Rhizome)系禾本科植物蘆葦(Phragmites communis Trin.)的新鮮或干燥根莖，具有悠久的藥用及食用歷史，屬清熱瀉火藥［1］。性甘、味寒，歸肺、胃經(jīng)。傳統(tǒng)中醫(yī)藥認(rèn)為蘆根清熱生津、舒肝解郁、除煩、止嘔、利尿。主要用于熱病煩渴、胃熱嘔吐、肺熱咳嗽、肺癰吐膿、熱淋澀痛等的治療。在多本草藥圖志及醫(yī)家經(jīng)典中有所記載。蘆根中含有多種化學(xué)成分，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蘆根含有51%的糖類、5%的蛋白質(zhì)、1%的脂肪及多種有機(jī)酸、維生素和微量元素［2］，其中以多糖成分為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。研究表明，蘆根多糖具有一定保肝作用［3－4］，但目前對(duì)于蘆根多糖的理化性質(zhì)及活性等方面尚未有系統(tǒng)而全面的研究。筆者在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)蘆根多糖的理化性質(zhì)和體外抗腫瘤作用進(jìn)行研究分析，希望能夠?yàn)樘剿髌渥鳛樾滤幤坊霞笆称饭δ苄猿煞仲Y源的可行性提供依據(jù)，并為蘆根的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

2011－08－25 *通訊聯(lián)系人

晁若瑜(1986－)，女，在讀碩士，研究方向:海洋藥物。

上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目(09YZ265);上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)。