梁 慧，馬海霞，李來(lái)好，*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)部華南水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究中心，廣東廣州510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)

臘魚(yú)產(chǎn)香酵母菌的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)香特性初步研究

梁 慧1，2，馬海霞1，李來(lái)好1，*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)部華南水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究中心，廣東廣州510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)

從傳統(tǒng)臘魚(yú)中分離篩選得到了兩株產(chǎn)香酵母。結(jié)合形態(tài)學(xué)和酵母菌26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析，初步鑒定一株為季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii，H9)，另一株為近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis，J11)。采用固相微萃取(SPME)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)分析兩株酵母麥芽汁發(fā)酵液的揮發(fā)性成分。結(jié)果表明，兩株酵母的麥芽汁發(fā)酵液中的揮發(fā)性成分主要為醇類(lèi)和酯類(lèi)，但種類(lèi)和組成差異較大。最后，對(duì)兩株酵母進(jìn)行耐鹽性、亞硝酸鹽耐受性、耐酸性等發(fā)酵適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，近平滑假絲酵母的發(fā)酵適應(yīng)性強(qiáng)于季也蒙畢赤酵母，有望將其開(kāi)發(fā)成為新型肉品發(fā)酵劑。

臘魚(yú)，產(chǎn)香，酵母菌，26S rDNA，發(fā)酵特性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臘魚(yú) 湖北荊州自制臘魚(yú);麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;YEPD液體培養(yǎng)基配方酵母粉 10g，蛋白胨 20g，葡萄糖 20g，蒸餾水1000mL，pH 6.0，115℃濕熱滅菌20min;麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基葡萄糖1.0g，KCl 1.8g，酵母粉2.5g，醋酸鈉8.2g，瓊脂15g，蒸餾水 1000mL，121℃濕熱滅菌 20min; Biospin真菌基因組提取試劑盒 杭州博日科技有限公司;破壁酶 廣州東盛生物科技有限公司;山梨醇緩沖液 廣州東盛生物科技有限公司;PCR master mix 2× Fermentas;瓊脂糖 西班牙 Biowest;NaCl (分析純)。

明鑒SPX型智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 日本YAMATO公司;超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;冷凍離心機(jī)Sigma;Eppendorf梯度 PCR儀 德國(guó)艾本德公司; Tanon1600型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng) 上海天能科技有限公司;紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)Spectronic genesysTM5 賽默飛世爾科技公司;手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、15mL進(jìn)樣瓶、65μmPDMS/DVB纖維萃取頭 美國(guó)Supleco公司;島津GC-MS 2010plus日本Shimadzu公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌分離純化 無(wú)菌條件下稱(chēng)取25g剪碎魚(yú)肉置于225mL生理鹽水中，充分振蕩，菌懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布在麥芽汁瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)3d。選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進(jìn)一步劃線分離純化，直至得到純菌株。

1.2.2 產(chǎn)香酵母菌的篩選 將分離純化得到的菌株分別接入麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于28℃搖床培養(yǎng)1d，28℃靜置培養(yǎng)2d。感官評(píng)定篩選出發(fā)酵液產(chǎn)生醇香、酯香的菌株。

1.2.3 酵母菌耐鹽性 以2%的接種量將酵母菌接種于氯化鈉含量分別為0、2%、4%、6%、8%、10%的YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)24h，于600nm處測(cè)定OD值。

1.2.4 酵母菌亞硝酸鹽耐受性 以2%的接種量將酵母菌接種于亞硝酸鹽含量分別為0、5、100、150mg/kg的YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng) 24h，于600nm處測(cè)定OD值。

1.2.5 酵母菌耐酸性 以2%的接種量接種酵母菌于用乳酸調(diào)節(jié)pH為4.0、5.0、6.0和7.0的YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)24h，于600nm處測(cè)OD值。

1.2.6 酵母的形態(tài)培養(yǎng)特征觀察 固體培養(yǎng)特征觀察：將分離純化后的酵母菌株涂布到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)72h，觀察菌落大小、色澤、表面形態(tài)、邊緣情況等特征。液體培養(yǎng)特征觀察：將分離純化后的酵母接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)72h后觀察有無(wú)醭以及有無(wú)沉淀物。在油鏡下觀察酵母的菌體形態(tài)及出芽方式，同時(shí)觀察酵母菌的子囊孢子、擲孢子和假菌絲產(chǎn)生情況［8-9］。

1.2.7 產(chǎn)香酵母菌的鑒定 按照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒的方法提取酵母菌的DNA，根據(jù)KURTZMAN等［10］的方法擴(kuò)增分離菌株26S rDNA的D1/D2區(qū)域，引物為NL1(5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25μL)：PCR master mix 2× (Fermentas)12.5μL，引物 NL1/NL4(10μmol/L)各1μL，模板DNA 2μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物由華大基因測(cè)序完成。應(yīng)用BLAST程序，將所獲得的26S rDNAD1/D2區(qū)序列與NCBI-GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知酵母菌相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析，以確定菌種歸屬。

1.2.8 SPME法提取發(fā)酵液中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)取菌株麥芽汁液體培養(yǎng)基發(fā)酵液(28℃搖床培養(yǎng)1d，28℃靜置培養(yǎng)2d)8mL置于15mL的樣品瓶?jī)?nèi)，加入2g NaCl加蓋封口，將樣品瓶置于50℃平衡10min，用固相微萃取手柄將探頭插入萃取瓶中，退出探頭，使探頭置于樣品瓶的頂空部分(分析前萃取頭在GC進(jìn)樣口處250℃解析5min)，于50℃的磁力攪拌器上1000r/min萃取30min，萃取完成后在進(jìn)樣口解析7min［11-12］，用于氣相色譜檢測(cè)酵母菌麥芽汁液體培養(yǎng)基發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味成分。

1.2.9 菌株發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味成分GC/MS分析條件 色譜條件：DB-5MS型色譜柱(30m×0.25mm× 0.25μm)。不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度250℃;升溫程序：35℃，保留 2min，以 1℃/min升到 65℃，再以6℃/min升到220℃，保持3min;載氣為高純氦氣，流速為1mL/min。質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電離電壓70eV;離子源溫度為230℃;掃描范圍33～450m/z，掃描方式為scan。

各組分經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)NIST05.LIB譜庫(kù)檢索并與相關(guān)文獻(xiàn)比較，報(bào)道匹配度最大的結(jié)果，并通過(guò)面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)性成分的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株產(chǎn)香酵母的培養(yǎng)特征觀察

分離得到兩株產(chǎn)香酵母菌H9和J11，發(fā)酵液的感官香氣分別為醇香和酯香，其培養(yǎng)特征如表1所示。

表2 分離酵母菌株26S rDNA序列相似性分析

表1 酵母菌的菌落及菌體形態(tài)和液體培養(yǎng)特征

2.2 兩株產(chǎn)香酵母分離株的PCR結(jié)果

以NL1和NL4為引物對(duì)篩選所得的菌株DNA進(jìn)行酵母菌特異性PCR擴(kuò)增得到26S rDNA中D1/ D2區(qū)域序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段長(zhǎng)度均為600bp左右，且無(wú)明顯非特異性條帶，如圖1所示。

圖1 酵母H9和J11PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 26S rDNA序列分析

經(jīng)測(cè)定，H9和 J11兩株產(chǎn)香酵母菌 26S rDNAD1/D2區(qū)序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為595bp和617bp，將兩組序列應(yīng)用 BLAST程序與 NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知酵母菌序列進(jìn)行相似性比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株H9的26S rDNAD1/D2區(qū)序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中 Meyerozyma guilliermondii (Pichia guilliermondiiATCC 6260)登 錄 號(hào) 為AAFM01000051的序列相比，僅有2bp的差異，同源性達(dá)到99.66%;菌株 J11與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中Candida parapsilosis CDC317 登 錄 號(hào) 為CABE01000013的序列相比，除多了3個(gè)核苷酸，還有10bp的差異，同源性為98.37%，鑒定結(jié)果如表2所示。

2.4 產(chǎn)香酵母發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

H9和J11兩株產(chǎn)香酵母發(fā)酵液的揮發(fā)性成分氣相色譜圖如圖2、圖3所示，各組分質(zhì)譜經(jīng)計(jì)算機(jī)NIST05.LIB譜庫(kù)檢索及相關(guān)資料分析，用峰面積歸一化法，計(jì)算各組分相對(duì)百分含量，并分析各組分的氣味，將揮發(fā)性成分按照保留時(shí)間先后順序統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表3。

圖2 酵母H9麥芽汁發(fā)酵液揮發(fā)性成分總離子流色譜圖

圖3 酵母J11麥芽汁發(fā)酵液揮發(fā)性成分總離子流色譜圖

從表3可以看出，酵母J11比酵母H9出峰率高，產(chǎn)生的揮發(fā)性成分較多，酵母H9麥芽汁發(fā)酵液共分離出11種揮發(fā)性風(fēng)味成分，酵母J11麥芽汁發(fā)酵液共分離出17種揮發(fā)性成分，兩株產(chǎn)香酵母的麥芽汁發(fā)酵液揮發(fā)性成分主要是醇類(lèi)和酯類(lèi)，但醇和酯的含量以及組成各異。酵母H9麥芽汁發(fā)酵液的主體風(fēng)味物質(zhì)是醇類(lèi)，異戊醇和苯乙醇的相對(duì)百分含量分別達(dá)到57.39%和23.20%，和酵母J11發(fā)酵液相比酯類(lèi)的種類(lèi)相對(duì)較少，這與感官評(píng)定其發(fā)酵液的主體香味為醇香一致，同時(shí)酵母H9發(fā)酵液中產(chǎn)生一種特有的具有香辛料、丁香和發(fā)酵似香氣和炒花生氣息的酚類(lèi)揮發(fā)性成分4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。酵母J11的揮發(fā)性成分中含有大量不同的酯類(lèi)，且大多數(shù)具有令人愉悅的香氣，因而賦予該菌株發(fā)酵液濃郁的酯香。有研究表明，酵母是具有很大產(chǎn)油潛力的微生物［13］，高媛［14］等也篩選到高產(chǎn)油的假絲酵母。該研究發(fā)現(xiàn)酵母J11發(fā)酵液中存在大量的高級(jí)脂肪酸酯類(lèi)，包括飽和脂肪酸酯(十二酸乙酯、十四酸乙酯和十六酸乙酯等)和不飽和脂肪酸酯(3，6-十二碳二烯酸甲酯、反式-4-癸烯酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯等)，由此可以推測(cè)，酵母J11可能是一株產(chǎn)油脂的酵母菌，其細(xì)胞裂解后將代謝產(chǎn)生的脂肪酸釋放到發(fā)酵液中，并與發(fā)酵液中的低級(jí)醇形成脂肪酸酯。

2.5 兩株產(chǎn)香酵母的發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 耐鹽性 食鹽是肉制品加工中必不可少的添加調(diào)味料，添加量一般在2%～6%左右，適宜于發(fā)酵肉制品的菌株必須有良好的食鹽耐受性，一般要求能夠在至少6%食鹽濃度下能夠正常生長(zhǎng)［15］。由圖4可以看出，當(dāng)食鹽添加量小于4%時(shí)，酵母H9和J11的生長(zhǎng)狀況良好，但當(dāng)食鹽的添加量超過(guò)4%時(shí)，隨著食鹽添加量的增加，兩株酵母的生長(zhǎng)開(kāi)始受到不同程度的抑制，其中食鹽對(duì)酵母H9的抑制作用非常明顯。當(dāng)食鹽添加量達(dá)到8%～10%時(shí)，酵母H9生長(zhǎng)幾乎停滯，而酵母J11的生長(zhǎng)略有下降。酵母J11的耐鹽性要明顯好于酵母H9。

表3 菌株H9、J11麥芽汁發(fā)酵液揮發(fā)性成分相對(duì)峰面積及氣味

圖4 不同食鹽含量對(duì)酵母H9和J11生長(zhǎng)的影響

2.5.2 亞硝酸鹽耐受性 在肉制品的加工中通常通過(guò)添加NaNO2對(duì)肉制品進(jìn)行發(fā)色，并且NaNO2還有抑制腐敗菌的作用。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定腌臘肉制品中的亞硝酸鹽的最大使用量為150mg/kg［16］，因此要求用于肉制品發(fā)酵的菌種應(yīng)具有較好的亞硝酸鹽耐受性，一般要求菌種至少能耐受100mg/kg的亞硝酸鹽。由圖5可知，NaNO2添加量在0～150mg/kg范圍內(nèi)，酵母H9和J11的生長(zhǎng)均幾乎不受亞硝酸鹽添加量的影響，具有很好的亞硝酸鹽耐受性。

圖5 不同亞硝酸鹽含量對(duì)酵母H9和J11生長(zhǎng)的影響

2.5.3 耐酸性 酵母菌通常與乳酸菌復(fù)配應(yīng)用于肉制品發(fā)酵，很少單獨(dú)使用，因此，酵母菌必須能夠適應(yīng)乳酸菌所造成的酸性環(huán)境［17］。從圖6可以看出，酵母菌H9和J11在pH4.0～7.0范圍內(nèi)均生長(zhǎng)良好，但pH為4.0時(shí)，酵母H9的生長(zhǎng)受到了些許抑制，但仍能正常生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

從湖北臘魚(yú)中分離篩選得到H9和J11兩株產(chǎn)香酵母，分別初步鑒定為季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)和 近 平 滑 假 絲 酵 母 (Candida parapsilosis)。其中，酵母H9(Pichia guilliermondii)麥芽汁液體培養(yǎng)基的主體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為醇類(lèi)，還產(chǎn)生一種特有的呈香辛料、丁香和發(fā)酵似香氣和炒花生氣息的4-乙烯基-2-甲氧基苯酚;酵母 J11 (Candida parapsilosis)的麥芽汁液體培養(yǎng)基發(fā)酵液酯香濃郁，產(chǎn)酯更為豐富，能產(chǎn)生多種高級(jí)脂肪酸酯，這可能與其脂肪酸代謝有關(guān)。另外，酵母J11與酵母H9相比具有更優(yōu)良的耐鹽性、亞硝酸鹽耐受性、耐酸性等發(fā)酵特性。因此，酵母J11有望開(kāi)發(fā)為新型的肉品發(fā)酵劑，酵母H9的耐鹽性較差，有待進(jìn)一步的馴化和研究。

圖6 不同pH對(duì)酵母H9和J11生長(zhǎng)的影響

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Screening of aroma-producing yeast strains from dry-cured fish and initial study on their aroma-production and fermentation characteristics

LIANG Hui1，2，MA Hai-xia1，LI Lai-hao1，*
(1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，National Research and Development Center for Aquatic Product Processing，South China Research Center for Aquatic Product Processing and Quality Safety，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China; 2.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

Two yeast strains were isolated from dry-cured fish，and initially identified as Pichia guilliermondii(H9) and Candida parapsilosis(J11)by morphological characteristics and 26S rDNAD1/D2 domain sequence analysis. Volatile compounds from malt wort fermentation broth of yeast H9 and J11 were analyzed by headspace solidphase micro extraction(SPME)coupled to gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Results showed that volatile compounds from malt wort fermentation broth of two species yeast strains were mainly alcohols and esters，but of great difference in kind and composition.Finally，Candida parapsilosis was considered to have the potential to be developed as a new starter culture for meat because of its better fermentation adaptability such as salt tolerance，nitrite tolerance and acid resistance.

dry-cured fish;aroma production;yeast;26S rDNA;fermentation characteristics

TS254.1

A

1002-0306(2011)12-0213-05

產(chǎn)香酵母，是一類(lèi)能產(chǎn)生香味物質(zhì)的酵母菌，目前主要分離篩選產(chǎn)香酵母并將其應(yīng)用于白酒、葡萄酒、果汁、醬油、香精香料中［1］。產(chǎn)香酵母在代謝過(guò)程中主要產(chǎn)生醇類(lèi)和酯類(lèi)等香味物質(zhì)，從而賦予食品特有的香氣［2］。微生物作用下醇類(lèi)和酸類(lèi)的酯化反應(yīng)產(chǎn)生具有各種芳香氣味的酯類(lèi)，對(duì)提高產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)有重要作用。目前，酵母菌對(duì)發(fā)酵肉制品風(fēng)味的形成特點(diǎn)尚未有定論［3］。Olesen等［4］發(fā)現(xiàn)產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)能產(chǎn)生多種揮發(fā)性成分，特別是酯類(lèi)和醇類(lèi)，而漢遜氏德巴利酵母對(duì)揮發(fā)性成分的形成幾乎沒(méi)有作用;而另一些研究則表明德巴利酵母影響蛋白質(zhì)水解和揮發(fā)性成分產(chǎn)生，適量的德巴利酵母可以通過(guò)抑制脂肪氧化和促進(jìn)乙酯類(lèi)的形成來(lái)影響揮發(fā)性產(chǎn)物，但德巴利酵母過(guò)量將會(huì)產(chǎn)生大量的酸對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生負(fù)面影響［5-6］。目前，已有很多關(guān)于肉制品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(乳酸菌、葡萄球菌和微球菌等)篩選及應(yīng)用的研究，國(guó)外也早已將酵母菌應(yīng)用于發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)中，常選用的是漢遜氏德巴利酵母(Dabaryomyces hansenii)和法瑪塔假絲酵母(Candida famata)，但直接從傳統(tǒng)肉制品中篩選優(yōu)勢(shì)自然酵母菌株的研究甚少。國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)肉制品(如火腿、香腸、臘魚(yú)、臘肉等)中廣泛存在著優(yōu)良的自然菌株，是分離篩選優(yōu)良野生菌株的重要來(lái)源。該研究從傳統(tǒng)臘魚(yú)中篩選產(chǎn)香酵母菌，結(jié)合酵母菌的培養(yǎng)形態(tài)及26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析進(jìn)行快速分類(lèi)鑒定［7］，并研究其產(chǎn)香特性及其耐鹽性、亞硝酸鹽耐受性和耐酸性等相關(guān)發(fā)酵特性，旨在分離得到能夠應(yīng)用于肉制品加工的產(chǎn)香酵母，為開(kāi)發(fā)新的肉制品發(fā)酵劑提供一定的理論基礎(chǔ)。

2011-08-26 *通訊聯(lián)系人

梁慧(1986-)，女，碩士研究生，從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-49);國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2010GB23260577，2009GB2E200303，2010GB2E000335); 廣 東 省 科 技 計(jì) 劃 項(xiàng) 目(2009A020700004，2008A020100006;2009B020201003);廣東省海洋漁業(yè)科技推廣項(xiàng)目(A200899B02，A200901C01);農(nóng)業(yè)部中央級(jí)公益性科研院所基本科研項(xiàng)目(2010YD07)。