趙 晶，馬丹雅，張 筠，余善鳴，楊同舟，孟廣龍，張慶鋼

(1.黑龍江東方學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150076; 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030; 4.黑龍江天宏工程設(shè)計(jì)有限公司，黑龍江哈爾濱150001)

酪蛋白與還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性的研究

趙 晶1，馬丹雅1，張 筠1，余善鳴2，楊同舟3，孟廣龍4，張慶鋼2

(1.黑龍江東方學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150076; 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030; 4.黑龍江天宏工程設(shè)計(jì)有限公司，黑龍江哈爾濱150001)

采用酪蛋白同還原糖(葡萄糖∶乳糖=1∶1)發(fā)生美拉德反應(yīng)，研究其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)的抗氧化活性，測定了MRPs的還原力和對DPPH自由基的清除率。根據(jù)單因素及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酪蛋白與還原糖反應(yīng)得到的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性同反應(yīng)物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)起始pH存在一定的量效關(guān)系，并且確定酪蛋白濃度為3%、反應(yīng)溫度為100℃、反應(yīng)時(shí)間為6h、反應(yīng)起始pH10時(shí)是最佳美拉德反應(yīng)模式，此時(shí)MRPs的抗氧化活性較強(qiáng)，DPPH·清除率可達(dá)72.87%。

酪蛋白，還原糖，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，抗氧化性

美拉德反應(yīng)是指含游離氨基的化合物與還原糖之間的非酶促褐變反應(yīng)。美拉德反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，其反應(yīng)進(jìn)程和產(chǎn)物不僅與反應(yīng)物種類有關(guān)，而且還與反應(yīng)溫度、pH、時(shí)間及反應(yīng)體系的相態(tài)等因素相關(guān)［1］。美拉德反應(yīng)主要包括3個(gè)階段，其中除了最終階段生成的一些高分子化合物［2］，如蛋白黑素外，還有一系列中間階段的產(chǎn)物——還原酮及揮發(fā)性的含氮、含硫雜環(huán)化合物，這些產(chǎn)物均有一定的抗氧化活性。雖然美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard Reaction Products，下簡稱為MRPs)的抗氧化活性得到了廣泛的研究和認(rèn)可，可是其抗氧化機(jī)理還有待進(jìn)一步的探討［3］。由于美拉德反應(yīng)的過程及產(chǎn)物非常復(fù)雜，有關(guān)該反應(yīng)的理論研究進(jìn)展緩慢，反應(yīng)機(jī)理仍然不十分清楚。研究表明，美拉德反應(yīng)是一個(gè)漸進(jìn)的過程，除最終生成的類黑精外，在反應(yīng)過程中還有揮發(fā)性含氮(或硫)和雜環(huán)化合物及還原醛酮等物質(zhì)生成，而且某些物質(zhì)的抗氧化活性可與常用的食品抗氧化劑相媲美［4］。因此研究美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)抗氧化性能，用以代替酚類食用抗氧化劑，正逐漸引起人們的關(guān)注［4－5］，并對某些氨基酸與葡萄糖的MRPs的抗氧化活性進(jìn)行了初步探討。本實(shí)驗(yàn)采用酪蛋白與還原糖在不同反應(yīng)溫度、反應(yīng)濃度、反應(yīng)時(shí)間和起始pH下建立美拉德反應(yīng)體系，通過測定還原力和對DPPH自由基的清除率來判斷美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)過程主要是探討高溫中抗氧化性的變化對體系的影響，為科學(xué)評價(jià)食品抗氧化劑使用標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，同時(shí)為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物作為抗氧化劑的市場走向開辟了新的研究領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白，葡萄糖，乳糖，磷酸緩沖溶液，F(xiàn)eCl3，鐵氰化鉀，三氯乙酸(TCA)，DPPH試劑，NaOH溶液等。

S54型紫外分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;DKS－11型電熱恒溫水浴鍋 上海沈蕩中新電器廠;TDL－40B臺式離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠; 98－1－B型電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備 準(zhǔn)確稱取葡萄糖和乳糖(分別為1.5g)以質(zhì)量比1∶1溶于50mL溫水中，備用。準(zhǔn)確稱取酪蛋白(1.5、3.0、4.5g)于一定溫度下溶解，待完全溶解之后移至250mL三口燒瓶中，并將配制的糖溶液加入其中。然后加去離子水至150mL，配制成酪蛋白濃度為1%、2%、3%的反應(yīng)液，最后用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為5、6、7、8、9和10，在80、90、100℃條件下恒溫反應(yīng)并且每隔一段時(shí)間進(jìn)行取樣，得到不同反應(yīng)條件下的美拉德產(chǎn)物。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn)得知，影響美拉德產(chǎn)物的抗氧化性主要因素有溫度、時(shí)間、pH、酪蛋白濃度。因此本實(shí)驗(yàn)以此為主要因素，在單因素的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以選擇最優(yōu)反應(yīng)條件。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平如表1。

表1 MRPs抗氧化性的正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.3 還原能力的測定(鐵氰化鉀還原法) 在2mL MRPs樣液中加入2.5mL 0.2mmol/L的磷酸緩沖溶液(pH=6.6)和2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻。50℃下保溫20min，加入10%的三氯乙酸(TAC) 2.5mL，振蕩搖勻后在3000r/min下離心10min，取上清液2mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%三氯化鐵溶液，靜置10min后在700nm下測其吸光度A。

1.2.4 對DPPH·清除率的測定 取 MRPs樣液2.5mL及2×10－2mol/L的DPPH溶液2.5mL加入同一具塞試管中搖勻，于室溫下密閉靜置30min，用無水乙醇與水混合液(體積比為1∶1)作參比，于517nm波長處測定吸光度［6］，清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)。

式中:A0－未加MRPs時(shí)DPPH溶液的吸光度; Ai－加MRPs后DPPH溶液的吸光度;Aj－MRPs的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時(shí)間對MRPs還原能力和DPPH·清除率的影響

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化效果與還原力密切相關(guān)。還原能力的測定是以樣品是否為良好的電子供體為指標(biāo)。還原能力大的樣品是良好的電子供體，其供應(yīng)的電子不僅能使Fe3+還原成Fe2+，同時(shí)能與自由基反應(yīng)，使自由基成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應(yīng)［7］，在700nm處吸光度越大表明樣品的還原力越強(qiáng)。

由圖1結(jié)果可知，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，吸光值增加，溶液顏色逐漸加深，表明形成了褐色的聚合體——類黑精，類黑精是美拉德反應(yīng)中的主要抗氧化成分。因?yàn)轭惡诰且环N以短肽和色素相結(jié)合的混合體，美拉德反應(yīng)時(shí)間越長，越有利于色素物質(zhì)產(chǎn)生，從而加深了反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度。隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長，產(chǎn)物的還原能力也顯著增強(qiáng)。這可能是因?yàn)樵陬惡诰旌象w中，其短肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)具有抗氧化肽的特征，因而具有還原性［8］。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)6h時(shí)還原能力達(dá)到最大，隨后吸光度開始降低，還原力有所減少，這可能是由于長時(shí)間加熱后導(dǎo)致還原性物質(zhì)分解所致。

圖1 MRPs還原力及DPPH·清除率隨反應(yīng)時(shí)間的變化

從圖1結(jié)果也可以看出，酪蛋白與還原糖反應(yīng)制得的MRPs清除DPPH·的能力隨著時(shí)間的延長而增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5h時(shí)，其反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH·清除率達(dá)到最高。因美拉德反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間，美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物與氨基化合物進(jìn)行醛基－氨基反應(yīng)最終生成類黑精，其短肽含有抗氧化活性的支鏈氨基酸，而且在產(chǎn)生類黑精的同時(shí)，有一系列的美拉德反應(yīng)中間體——還原酮類物質(zhì)及雜環(huán)類化合物生成，這些產(chǎn)物也具有抗氧化等活性［9］。

2.2 反應(yīng)溫度對MRPs還原能力和DPPH·清除率的影響

由圖2可見，不同溫度加熱反應(yīng)得到的MRPs的吸光度不同，吸光度隨溫度的升高而增加。80℃時(shí)其吸光度低，100℃時(shí)吸光度明顯增加，說明低于100℃時(shí)，反應(yīng)溫度越高，反應(yīng)越劇烈，顏色越深。美拉德反應(yīng)在一定溫度反應(yīng)后冷卻，反應(yīng)并沒結(jié)束。加熱結(jié)束后將反應(yīng)液冷卻至室溫放置，分別于4h和24h測定其吸光度，其結(jié)果是它們的吸光度都有所降低。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及其中間產(chǎn)物的成分是復(fù)雜的，在本實(shí)驗(yàn)條件下，加熱結(jié)束，吸光度還在變化，可能是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)或是進(jìn)行了重排，導(dǎo)致吸光度顯示少量降低。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析確定反應(yīng)溫度100℃時(shí)MRPs的還原力最強(qiáng)。

溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物DPPH·的清除率影響也很大，在80～100℃之間，溫度越高，DPPH·的清除率越高，即抗氧化能力越強(qiáng)。因?yàn)闇囟雀哂欣诿览路磻?yīng)，溫度越高在較短時(shí)間內(nèi)就能生成類黑精、還原酮及一系列含N、含S的雜環(huán)化合物，這些物質(zhì)都具有清除DPPH·的能力。因此反應(yīng)溫度在100℃時(shí)MRPs對DPPH·的清除率最大。

圖2 MRPs還原力及DPPH·清除率隨溫度變化圖

2.3 pH對MRPs還原能力和DPPH·清除率的影響

由圖3可見，美拉德反應(yīng)在pH為5.0～6.0時(shí)，其吸光度趨于零，所以在pH 5.0～6.0的酸性范圍內(nèi)美拉德反應(yīng)的色值趨于零。當(dāng)pH＞6.0時(shí)，吸光度明顯增加，在pH7.0～10.0時(shí)逐漸增大。pH對美拉德反應(yīng)的影響，其原因一般認(rèn)為，在酸性溶液中，由于氨基處于質(zhì)子化狀態(tài)，帶正電荷N原子的吸引，使1，2－烯醇化較為容易，使得葡基胺不能形成，在這樣的條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性不顯著［9－11］。在堿性條件下，由于鄰近N原子的影響，糖堿基C1上電子密度增大，使1，2－烯醇化困難，所以在堿性介質(zhì)中，一般進(jìn)行2，3－烯醇化即而生成較多的抗氧化產(chǎn)物。因而根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和相關(guān)理論，認(rèn)為反應(yīng)pH 10.0時(shí)MRPs的還原力較好。

圖3 MRPs還原力及DPPH·清除率隨pH變化圖

同樣，MRPs在堿性條件下對DPPH自由基清除率也較高，在pH5～11范圍內(nèi)隨pH升高，清除率先增加后降低，且在pH10時(shí)最大，即抗氧化能力最強(qiáng)。在強(qiáng)堿性條件下促進(jìn)顏色加深，類黑素生成較多，清除率增強(qiáng)，這在咸味香精生產(chǎn)中也有特殊意義。

2.4 酪蛋白濃度對MRPs還原能力和DPPH·清除率的影響

酪蛋白濃度的不同代表反應(yīng)體系中氨基與羰基的比例不同。酪蛋白濃度在1%～3%之間，初期隨酪蛋白濃度增大，MRPs的還原力增加，這說明反應(yīng)物濃度較大，利于反應(yīng)的進(jìn)行。但隨酪蛋白濃度的繼續(xù)增加，氨基的增多使分子內(nèi)氨基和羧基會失水形成內(nèi)酰胺而降低了參與美拉德反應(yīng)的氨基的物質(zhì)量，使褐變速率減緩，因而酪蛋白濃度為2%時(shí)，MRPs的還原力最大。

圖4 MRPs還原力及對DPPH·清除率隨反應(yīng)物濃度變化圖

反應(yīng)物濃度的改變對DPPH·清除率變化影響也較大。酪蛋白濃度在1%～3%范圍內(nèi)，隨著酪蛋白濃度的升高，MRPs對DPPH·的清除率先增加后降低，當(dāng)酪蛋白濃度達(dá)到2%(W/V)，其清除DPPH·能力較高，這與酪蛋白濃度對MRPs的還原力影響結(jié)果一致。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

為了從反應(yīng)中了解各種因素對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性的影響，綜合單因素實(shí)驗(yàn)方法所得相關(guān)結(jié)果，以反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH和酪蛋白濃度為因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表

表2是美拉德反應(yīng)正交實(shí)驗(yàn)所得相關(guān)數(shù)據(jù)，比較四個(gè)因素R值的大小，溫度極差值是四個(gè)因素中的最大值，其次是pH，酪蛋白濃度，最后是反應(yīng)時(shí)間，即溫度＞pH＞酪蛋白濃度＞時(shí)間。最佳清除DPPH·的MPRs的反應(yīng)條件為:溫度100℃、時(shí)間6h、pH 10、酪蛋白濃度3%，經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明:此條件下制得的MPRs對DPPH·清除率可達(dá)72.87%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以酪蛋白和還原糖(葡萄糖∶乳糖=1∶1)在一定條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)，并對其產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化測定。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，影響MPRs抗氧化性的最主要因素是反應(yīng)溫度，其次是反應(yīng)起始pH。通過正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)條件是:溫度100℃，時(shí)間6h，pH 10，酪蛋白濃度為3%，此時(shí)MPRs的DPPH·清除率為72.87%。

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Research of oxidation resistance of casein and reducing sugar Maillard reaction products

ZHAO Jing1，MA Dan－ya1，ZHANG Yun1，YU Shan－ming2，YANG Tong－zhou3，MENG Guang－long4，ZHANG Qing－gang2
(1.East University of Heilongjiang，Harbin 150086，China;2.Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China; 3.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 4.Heilongjiang TianHong Engineering Design Co.，Ltd.，Harbin 150001，China)

The Maillard reaction products(MRPs)were prepared by using casein and reducing sugar(the quality ratio of glucose and lactose was 1∶1).To study MRPs antioxidant activity，reducing power and DPPH radical clearance were determined.The single factor and orthogonal experiment results showed that MRPs antioxidant activity and concentration of reactants，reaction temperature，reaction time，reaction starting pH had certain quantity－efficiency relation.The optimum Maillard reaction model was the reactants concentration of 3%，reaction temperature of 100℃，reaction time of 6h，and reaction initial pH of 10，under this condition，MRPs antioxidant activity was the strongest and DPPH radical clearance ratio was 72.87%.

casein;reducing sugar;Millard reaction products;oxidation resistance

TS201.2

A

1002－0306(2011)12－0187－04

2011－08－29

趙晶(1978－)，女，碩士研究生，講師，研究方向:食品化學(xué)。

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(11553074)。