王 芳，田仕夫，鄔樹(shù)偉，劉常金

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響及分子機(jī)理研究

王 芳，田仕夫+，鄔樹(shù)偉，劉常金*

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

目的:研究白藜蘆醇延長(zhǎng)壽命的效果和抗衰老的分子機(jī)理。方法:以模式生物秀麗線蟲(chóng)為材料，觀察在正常(25℃)和熱應(yīng)激(35℃)培養(yǎng)條件下，空白對(duì)照組和終濃度為50mg/L和100mg/L的白藜蘆醇藥物組對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響;用半定量RT-PCR方法對(duì)衰老相關(guān)基因Abnormal dauer formation protein 16(daf-16)、superoxide dismutase-3 (sod-3)、heat shock protein-16.2(hsp-16.2)的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果:在兩種培養(yǎng)條件下，與空白組比較，藥物組的線蟲(chóng)壽命都顯著延長(zhǎng)，且100mg/L終濃度白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)作用更顯著;藥物組衰老相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:白藜蘆醇通過(guò)上調(diào)daf-16、sod-3和hsp-16.2基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的延長(zhǎng)，研究結(jié)果為白藜蘆醇抗衰老機(jī)制研究提供重要參考。

白藜蘆醇，秀麗線蟲(chóng)，壽命相關(guān)基因，半定量RT-PCR

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇 天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司惠贈(zèng);5-氟脲嘧啶(5-Fu) 美國(guó)sigma公司;羥丙基環(huán)糊精 廣州泰龍生化公司;TRIZOL試劑 美國(guó)Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄酶及Taq DNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司;核酸染料(gelview) 北京百泰克生物技術(shù)有限公司;大腸桿菌OP50 由美國(guó)線蟲(chóng)中心CGC提供;野生型線蟲(chóng)N2 由北京生命科學(xué)研究所惠贈(zèng)。

凝膠成像分析儀及普通PCR儀(MyCycler 170-9703) 美國(guó)Bio-Rad公司;移液器、小型離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司;電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白藜蘆醇的環(huán)糊精包埋 白藜蘆醇是非水溶的天然產(chǎn)物。羥丙基環(huán)糊精可溶于水，是很好的包埋劑。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室研究表明，可用羥丙基—環(huán)糊精以一定比例對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行包埋。

在40mL無(wú)水乙醇中緩慢加入2g白藜蘆醇，并不斷攪拌至白藜蘆醇全部溶解。向30mL蒸餾水中緩慢加入20g環(huán)糊精并不斷攪拌至環(huán)糊精全部溶解。再將溶解有環(huán)糊精的30mL液體放入溫度設(shè)為37℃的恒溫加熱磁力攪拌器上。將白藜蘆醇的乙醇溶液以3mL/min的速率逐滴加入到不斷攪拌的環(huán)糊精水溶液中。50℃、80r/min真空旋蒸至酒精完全揮發(fā)，時(shí)間不宜太長(zhǎng)，防止白藜蘆醇氧化。待白藜蘆醇的乙醇溶液完全加入到環(huán)糊精水溶液中后，避光保存于4℃冰箱中。

1.2.2 線蟲(chóng)壽命觀察

1.2.2.1 線蟲(chóng)的喂養(yǎng) 線蟲(chóng)的培養(yǎng)使用線蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(NGM)，根據(jù)文獻(xiàn)［3］配制。E.coli OP50用作線蟲(chóng)的食物。培養(yǎng)溫度為25℃。

1.2.2.2 線蟲(chóng)的同期化 當(dāng)需要同期化線蟲(chóng)數(shù)目較多時(shí)，采取高氯酸鈉漂白法。準(zhǔn)備孕蟲(chóng)生長(zhǎng)板2～3個(gè)。

a.用無(wú)菌蒸餾水沖洗孕蟲(chóng)生長(zhǎng)板，將含孕蟲(chóng)的蒸餾水吸入1.5mL離心管中，1500×g離心3min，棄去上清液。

b.加入1mL新配同期化漂白液，室溫下劇烈震蕩3min，以將成蟲(chóng)蟲(chóng)體腐蝕。

c.2000×g離心3min，棄去上清。b與c步驟總時(shí)間不能超過(guò)7min，否則將損傷蟲(chóng)卵。

d.用無(wú)菌蒸餾水將沉淀重懸，混合后1000×g離心3min，棄去上清。

e.將沉淀混勻，取NGM培養(yǎng)皿，將重懸后的沉淀接種至培養(yǎng)皿中，約200μL/板接種。

附：線蟲(chóng)同期化試劑(5mL)：NaOH(0.5mol/L) 0.5mL，NaClO(8%～9%)0.5 mL，H2O 4.0mL。

1.2.2.3 線蟲(chóng)壽命觀察 實(shí)驗(yàn)設(shè)定空白對(duì)照組(白藜蘆醇終濃度為0mg/L)、低濃度藥物劑量組(白藜蘆醇終濃度為50mg/L)、高濃度藥物劑量組(白藜蘆醇終濃度為100mg/L)，每組90條線蟲(chóng)，每平板30條。

a.正常培養(yǎng)溫度(25℃)下線蟲(chóng)壽命的觀察：把白藜蘆醇加入到 NGM培養(yǎng)基中配成不同終濃度(50mg/L、100mg/L)的培養(yǎng)液，然后將 E.Coli OP50涂布到配制好的NGM培養(yǎng)基上。使用次氯酸鈉溶液對(duì)秀麗線蟲(chóng)進(jìn)行同步化，把新孵出的L1期線蟲(chóng)在涂有E.coli OP50的NGM培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)線蟲(chóng)進(jìn)入產(chǎn)卵期(第 3.5d)時(shí)，把線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至加有400μmol/L FUDR的培養(yǎng)基，以抑制卵的孵出。在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在從加藥處理開(kāi)始的10d內(nèi)，每隔一天把線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至新配制的培養(yǎng)皿中，10d后不用藥物處理。在10d中，每隔一天換一次培養(yǎng)基，線蟲(chóng)壽命統(tǒng)計(jì)從轉(zhuǎn)板的第二天開(kāi)始，每天詳細(xì)記錄線蟲(chóng)死亡數(shù)。數(shù)量統(tǒng)計(jì)采用雙盲(double-blind)統(tǒng)計(jì)方法。

b.熱應(yīng)激(35℃)條件下線蟲(chóng)壽命的觀察：對(duì)照組不用藥物處理，藥物處理組分別用終濃度為50mg/L和100mg/L的培養(yǎng)基預(yù)處理處于L1期的線蟲(chóng)48h，然后轉(zhuǎn)移到35℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱應(yīng)激。每半小時(shí)計(jì)數(shù)死亡蟲(chóng)子的數(shù)目并做詳細(xì)記錄。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用雙盲的統(tǒng)計(jì)方法。

1.2.3 線蟲(chóng)壽命相關(guān)基因的表達(dá)分析

1.2.3.1 線蟲(chóng)RNA提取 線蟲(chóng)同期化孵出幼蟲(chóng)后，繼續(xù)在平板上培養(yǎng)5d，采用TRIZOL法提取25℃條件下空白對(duì)照組(0mg/L)和壽命延長(zhǎng)最顯著的藥物實(shí)驗(yàn)組(100mg/L)總RNA，瓊脂糖電泳確定其完整性。提取的RNA通過(guò)直接用作模板，用ama-1引物做PCR進(jìn)行純度檢驗(yàn)，如無(wú)擴(kuò)增條帶則認(rèn)為無(wú)DNA污染，如有擴(kuò)增條帶則進(jìn)一步用RNase free的DNaseI消化，確定無(wú)DNA污染后再用作RT-PCR模板。

1.2.3.2 PCR反應(yīng)條件及引物 PCR反應(yīng)條件：94℃，4min(1個(gè)循環(huán));94℃，30s，55℃(可變)，30s，72℃，50s(30個(gè)循環(huán));72℃，10min。相關(guān)引物如下，由上海生物工程有限公司合成。

daf-16：TTCCCCTTTCTCTCGTCTAATTC(上游)和CATCATCATCATACAGTCTCAAA(下游)。

sod-3：AGTAGTAGGCGTGCTCCCAA(上游)和TGTGCTGACACCGAAATGTT(下游)。

hsp-16.2：CGTCGAAGAGAAATCTGCTGAA(上游)和TGCAGCGAACAATACTGTAATTTATG(下游)。

ama-1：GGACGACGTGTTCCTACGAT(上游)和GTTGGCGAATAACTGGGAGA(下游)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理工具與統(tǒng)計(jì)方法 壽命實(shí)驗(yàn)及應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0的Kalpan-Meir存活曲線分析程序分析。加藥處理組和對(duì)照組之間的比較使用SPSS 16.0的Kaplan-Meier Log-rank兩兩比較程序分析，由此計(jì)算出p值來(lái)表示其顯著性。如果p＜0.05則表示有顯著差異;p＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

2.1.1 正常培養(yǎng)條件下(25℃)白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響 本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)糊精包埋的白藜蘆醇，其水溶性更好，在培養(yǎng)基中可均勻分布，增強(qiáng)了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

在正常培養(yǎng)條件下(25℃)觀察統(tǒng)計(jì)白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組(0mg/L)相比，低劑量藥物組(50mg/L)線蟲(chóng)平均壽命提高了14.06%(p＜0.01)，高劑量藥物組(100mg/L)線蟲(chóng)平均壽命提高了22.10%(p=0.001)，藥物組的最大壽命也長(zhǎng)于對(duì)照組。對(duì)線蟲(chóng)全程生存情況做生長(zhǎng)曲線，兩種劑量的白藜蘆醇均能使曲線右移，而且高劑量組對(duì)壽命的延長(zhǎng)效果好于低劑量組(見(jiàn)圖1)，可見(jiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響具有劑量依賴性。

圖1 25℃培養(yǎng)條件下線蟲(chóng)生長(zhǎng)曲線

2.1.2 熱應(yīng)激條件下(35℃)白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響 在熱應(yīng)激條件下(35℃)觀察統(tǒng)計(jì)白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組(0mg/L)相比，低劑量藥物組(50mg/L)線蟲(chóng)壽命提高了11.87%(p＜0.05);高劑量藥物組(100mg/L)線蟲(chóng)壽命提高了22.64%(p＜0.05)，藥物組的最大壽命也長(zhǎng)于對(duì)照組。對(duì)線蟲(chóng)全程生存情況做生長(zhǎng)曲線，兩種劑量的白藜蘆醇均能使曲線右移，且高劑量組(100mg/L)延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命效果更為明顯(見(jiàn)圖2)。可見(jiàn)，在熱應(yīng)激條件下，在一定濃度范圍內(nèi)，白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)壽命的延長(zhǎng)也具有劑量依賴性。

圖2 35℃培養(yǎng)條件下線蟲(chóng)生長(zhǎng)曲線

2.2 白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)衰老相關(guān)基因的影響

線蟲(chóng)用100mg/L的白藜蘆醇喂食5d后，線蟲(chóng)內(nèi)衰老相關(guān)基因發(fā)生變化，通過(guò)半定量RT-PCR法分析其變化情況。以管家基因ama-1為內(nèi)參，與空白對(duì)照組相比，高劑量藥物組的基因daf-16、sod-3、hsp-16.2的表達(dá)都明顯上調(diào)(見(jiàn)圖3)。

daf-16是胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Insulin/ IGF-1)信號(hào)通路中編碼轉(zhuǎn)錄因子FOXO的基因，它被磷酸化后不能進(jìn)入細(xì)胞核，未被磷酸化的形式能向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)對(duì)壽命及免疫的調(diào)控［4］。當(dāng)面臨應(yīng)激時(shí)，JNK-1促進(jìn)daf-16向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而激活相關(guān)基因并提高線蟲(chóng)抵抗環(huán)境應(yīng)激的能力［4］。研究表明sod-3和hsp-16.2是位于daf-16下游的效應(yīng)因子，作為脅迫感應(yīng)器延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命［5-6］。sod-3是編碼超氧化物歧化酶(SOD)的基因，SOD能清除生命體內(nèi)多余的超氧化物和自由基，過(guò)表達(dá)SOD可以減少氧化損傷并延長(zhǎng)壽命［7］。hsp-16.2是一種分子伴侶，可以幫助蛋白正確折疊為天然構(gòu)象，對(duì)壽命起到正調(diào)節(jié)作用［8］。

圖3 線蟲(chóng)衰老相關(guān)基因的表達(dá)分析

3 結(jié)論

本研究利用模式生物線蟲(chóng)研究了白藜蘆醇的抗衰老效果及其分子機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在正常條件還是熱應(yīng)激條件下，白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)均有顯著的延長(zhǎng)壽命的效果?；虮磉_(dá)分析實(shí)驗(yàn)表明，高劑量藥物組的Insulin/IGF-1信號(hào)通路上游的轉(zhuǎn)錄因子daf-16表達(dá)上調(diào)，其下游的sod-3和hsp-16.2的表達(dá)量也相應(yīng)增加。由此推測(cè)，白藜蘆醇是通過(guò)上調(diào)Insulin/IGF-1信號(hào)通路中相關(guān)基因，提高線蟲(chóng)抵抗環(huán)境應(yīng)激的能力從而延緩線蟲(chóng)衰老的。

該研究為白藜蘆醇的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為其抗衰老機(jī)理的研究提供了新內(nèi)容。

［1］傅喆暾，張蓉，黃寶康，等.天然植物中活性成分白藜蘆醇的作用研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19(2): 62-64.

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The effect of resveratrol on Caenorhabditis elegans lifespan and its molecular mechanism

WANG Fang，TIAN Shi-fu+，WU Shu-wei，LIU Chang-jin*
(College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

Objective:To study the extending longevity effect and anti-senescence molecular mechanism of resveratrol.Method:The lifespan assay was carried out on model organism Caenorhabditis elegans(C.elegans) which dieted resveratrol with final concentration 50mg/L and 100mg/L under normal culture conditions(25℃)and under heat stress(35℃)，respectively.Semi-quantitative RT-PCR was used to analyze the expression of agingassociated genes such as daf-16，sod-3 and hsp-16.2.Result:Under the two kinds of culture conditions the C.elegans fed resveratrol was shown to extend lifespan compared to the control without resveratrol uptake. Furthermore，the resveratrol with final concentration 100mg/L had more obvious longevity-extending effect.The expression of aging-associated genes was up-regulated.Conclusion:The results suggested that resveratrol significantly extended the lifespan of C.elegans through up-regulating some genes’expression such as daf-16，sod-3 and hsp-16.2 which would provide important reference for antiaging research of resveratrol.

resveratrol;Caenorhabditis elegans;aging-associated genes;semi-quantitative RT-PCR

TS201.2

A

1002-0306(2011)12-0126-03

白藜蘆醇的抗衰老、抗氧化生理活性已得到了廣泛認(rèn)可［1］，但對(duì)于其分子機(jī)理的研究較少，目前研究認(rèn)為：白藜蘆醇作為限食(Caloric Restriction)的一種模擬物，可以通過(guò)與限食類似的機(jī)理延長(zhǎng)模式動(dòng)物壽命的作用。如Wood等發(fā)現(xiàn)［2］，100μmol/L的白藜蘆醇可模擬限食作用來(lái)激活基因SIR-2.1，從而延長(zhǎng)野生型線蟲(chóng)的壽命達(dá)14%。而利用野生型Canton-S果蠅進(jìn)行的壽命實(shí)驗(yàn)中，100μmol/L的白藜蘆醇可延長(zhǎng)果蠅的壽命達(dá)29%。對(duì)于白藜蘆醇是否還具有其它抗衰老的分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究白藜蘆醇對(duì)線蟲(chóng)在正常條件下(25℃)和熱應(yīng)激(35℃)條件下的壽命影響以及相關(guān)基因表達(dá)分析，探索了白藜蘆醇對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命影響的分子機(jī)理，為深入研究其作用機(jī)制提供重要理論參考。

2010-10-27 *通訊聯(lián)系人，+為并列第一作者。

王芳(1975-)，女，博士，講師，研究方向:植物基因工程與分子生物學(xué)。田仕夫(1984-)，男，在讀碩士，研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目資助。