陳梁軍

（福建生物工程職業(yè)技術學院，福建 福州 350002）

慶大霉素發(fā)酵工藝的研究

陳梁軍

（福建生物工程職業(yè)技術學院，福建 福州 350002）

目的通過對慶大霉素發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高發(fā)酵生產的能力。方法以絳紅色小單孢菌2-25為對象，通過單因素試驗和四因素三水平（4×3）正交試驗篩選出了菌株2-25的最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。結果該菌種的最佳發(fā)酵條件：5.0%玉米淀粉，3.0%黃豆餅粉，0.6%蛋白胨，0.15%硝酸鉀，在33℃、pH 7.8、接種量25%，培養(yǎng)84h，產品質量符合中國藥典2005版（CP2005）、美國藥典28（USP28）。結論優(yōu)化發(fā)酵條件后菌株2-25發(fā)酵水平明顯提高。

慶大霉素；絳紅色小單孢菌；發(fā)酵；正交試驗

慶大霉素（Gentamicin）是由絳紅色小單孢菌（Micromonmspora purpurea）產生的氨基糖苷類抗生素，對革蘭陽性、革蘭陰性菌特別是對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌有良好的抗菌效能，臨床肌內（靜脈）注射后吸收迅速、完全，故被廣泛應用于消炎退熱；同時，發(fā)現(xiàn)口服給藥在體內難以吸收，在腸道中保持較高濃度，確保其殺菌效果，又被臨床用于胃腸道和呼吸道感染。后又發(fā)現(xiàn)能促進飼料的利用率，在禽畜體內不留殘毒或低殘毒[1]，于是又被廣泛用于畜牧業(yè)，生產“綠色食品”。

我國生產的慶大霉素大部分出口。但由于小單孢菌產素率低，發(fā)酵用料多，周期長，因此生產成本高。為了提高我國在國際市場的競爭力，改進慶大霉素的生產方法已勢在必行。慶大霉素自1963年問世以來，生產徘徊在一定范圍水平，且生產周期較長，國內外均在120～140h。慶大霉素生產水平低的原因主要有：①菌種代謝合成能力有限；②孢子發(fā)芽率很低，新鮮培養(yǎng)的菌種發(fā)芽率僅有15%～20%；③代謝合成過程要求溶氧很高等，一般很難滿足[2]。根據(jù)絳紅色小單孢菌合成氨基糖苷類抗生素和合成抗生素過程中初級代謝與次級代謝的關系，進行正交設計改變培養(yǎng)基的成分和發(fā)酵培養(yǎng)條件，通過搖瓶小試，30L發(fā)酵中試的基礎上，在100m3發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，取得突破性進展。發(fā)酵周期較原工藝縮短約35%，發(fā)酵指數(shù)提高約43%，產品質量符合中國藥典2005版（CP2005）、美國藥典28版（USP28）。

1 材料與方法

1.1 菌種

絳紅色小單孢菌2-25由福建省?？顾帢I(yè)股份有限公司保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面及平板分離培養(yǎng)基（%）： 麩皮1.5%、瓊脂2.0%、碳酸鈣0.05%、天門冬酰胺0.01%，磷酸二氫鉀0.03%、硫酸鎂0.05%、氯化鈉0.05%、硝酸鉀0.2%和玉米淀粉1.0%，消前pH 6.3～6.5。

一級種子培養(yǎng)基（%）：葡萄糖0.2%、玉米淀粉1.2%、玉米粉2.0%、蛋白胨0.3%、黃豆餅粉1.2%、碳酸鈣0.7%、氯化鈷0.002%、硝酸鉀0.1%，消前pH 7.5～7.6。

二級種子培養(yǎng)基（%）：葡萄糖0.3%、玉米淀粉2.0%、玉米粉0.5%、蛋白胨0.4%、黃豆餅粉2.0%、碳酸鈣0.7%、氯化鈷0.001%，硫酸銨0.1%、硝酸鉀0.1%，淀粉酶0.01 %和泡敵0.02%，消前pH 7.5～7.6。

酵培養(yǎng)基（%）：葡萄糖0.5%、玉米淀粉5.0%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.6%、黃豆餅粉3.0%、碳酸鈣0.7%、氯化鈷0.001%、硫酸銨0.1%、硝酸鉀0.15%、淀粉酶0.02%和泡敵0.03%， 消前pH 7.5～7.6。

1.3 培養(yǎng)條件

斜面及平板培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度33℃，相對濕度45～65%，培養(yǎng)4～5d。

種子培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度34℃，相對濕度45～65%，搖瓶裝量30mL/250mL三角瓶，搖床轉速320r/min，培養(yǎng)48h。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度33℃，相對濕度45%～65%，搖瓶裝量30mL/250mL三角瓶，搖床轉速320r/min，接種量25%，培養(yǎng)4d。

30L小試發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度33℃，通氣1∶1.5（vvm），罐壓0.02Mpa，攪拌轉速600 r/min，接種量25%，培養(yǎng)4d。

100m3發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度33℃，通氣1∶1.2（vvm），罐壓0.02Mpa，攪拌轉速140 r/min，接種量25%，培養(yǎng)4d。

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1 初始pH值對抑菌物質產生的影響

在30L發(fā)酵罐中采用優(yōu)化培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液初始pH分別調至6.9、7.2、7.5、7.8、8.1、8.4。搖瓶發(fā)酵，測定發(fā)酵液生物效價。為排除pH干擾。將終發(fā)酵液pH全部調至7.0進行實驗。

1.4.2 培養(yǎng)溫度對抑菌物質產生的影響

在優(yōu)化培養(yǎng)基和最適pH下，分別選取了27℃、30℃、33℃、36℃、39℃作為菌株的發(fā)酵培養(yǎng)溫度，搖瓶發(fā)酵。實驗方法同上，測發(fā)酵液生物效價。

1.4.3 發(fā)酵時間對抑菌物質產生的影響

在優(yōu)化培養(yǎng)基和最適pH及最佳溫度下，搖瓶培養(yǎng)。實驗方法同上，每12h取發(fā)酵液測定生物效價。

1.5 分析方法

1.5.1 總糖和還原糖的測定

斐林試劑法[3]。

1.5.2 氨基氮的測定

甲醛法[3]。

1.5.3 生物效價的測定

按照中國藥典2005版（CP2005），抗生素微生物檢定法（附錄XIA），質量檢測按照中國藥典2005版規(guī)定。

1.6 正交試驗設計

將玉米淀粉、蛋白胨、黃豆餅粉和硝酸鉀四個因素設3個水平選擇無交叉作用的正交表L9（34）[4]，進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗。試驗設計如表1。

表1 正交試驗因素與水平

2 結 果

2.1 初始pH對產抑茵活性物質的影響

分別調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.9、7.2、7.5、7.8、8.1、8.4，進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵液生物效價。結果顯示該菌株在pH 6.9～8.4均有抑菌物質產生。在pH 7.8時達到最大值，pH超過7.8產抑菌物質量下降。

2.2 培養(yǎng)溫度對產抑茵活性物質的影響

以初始pH 7.8的培養(yǎng)基接種2-25菌懸液，分別置于27℃、30℃、33℃、36℃、39℃搖瓶培養(yǎng)，結果在33℃左右，2-25菌株產抑菌物質量最高。

2.3 發(fā)酵時間對產抑茵活性物質的影響

以初始pH 7.8的培養(yǎng)基接種2-25菌懸液，分別置于33℃搖瓶培養(yǎng)，每隔12h測定生物效價，結果顯示發(fā)酵生物效價隨著培養(yǎng)液培養(yǎng)時間的延長而增加，84h后，生物效價不再增加，說明2-25菌株在培養(yǎng)到84h時生物效價達最高峰。

2.4 正交試驗結果

以玉米淀粉，蛋白胨，黃豆餅粉，硝酸鉀四個因素進行正交試驗，試驗結果見表2。由表中極差可見 RC＞RB＞RD＞RA。即4個因素對發(fā)酵影響的強度依次為黃豆餅粉、蛋白胨、硝酸鉀、玉米淀粉。其最佳配比為A1B2C1D3。由試驗得出菌株2-25的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為黃豆餅粉3.0%，蛋白胨0.6%，硝酸鉀0.15%，，玉米淀粉5.0%。

表2 L9(34)正交試驗

2.5 驗證試驗

應用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在100m3發(fā)酵罐連續(xù)生產60批，發(fā)酵周期為84h較原工藝縮短約35%，發(fā)酵指數(shù)為1.3839較原工藝提高約43%，產品按照中國藥典2005版（CP2005）進行組分檢測：C1為27.8%，C1a為29.7%，C2a+C2為42.5%，符合CP2005標準（C1應為25%～50%，C1a應為15%～40%，C2a+C2應為20%～50%），也符合美國藥典28版（USP28）。

3 討 論

用正交試驗優(yōu)選得到的發(fā)酵培養(yǎng)基達到提高發(fā)酵水平的目的，發(fā)酵周期較原工藝縮短約35%，發(fā)酵指數(shù)提高約43%，產品質量符合中國藥典2005版（CP2005）、美國藥典28（USP28）。本試驗就慶大霉素發(fā)酵工藝條件和培養(yǎng)基配方進行了初步的篩選，對其高產菌種選育工作有待進一步研究。

[1]沈川,肖希龍.新霉素在動物體內的殘留及其測定方法[J].中國獸醫(yī)雜志,1998,32(2):53-56.

[2]管玉霞,劉樹滔.幾種氨基酸在慶大霉素生產中的作用[J].中國生物工程雜志,2007,27(12):95-100.

[3]Chen JM,Xu LD.Antibiotic industry analysis [M].Beijing:Chinese Medical Technology Publishing House,1991:109.

[4]夏志蘭,喻桃生,周連玉等.靈芝液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].微生物學雜志,2007,27(2):10-15.

Research of Fermentation Technology for Production of Gentamicin

CHEN Liang-jun
(Fujian Biological Engineering Vocational and Technical College, Fuzhou350002, China)

ObjectiveImprove fermentation production ability by optimization of the Gentamicin fermentation condition.MethodsThe optimum fermentation medium and culture condition of Gentamicin 2-25 was obtained by using one-factor experimental design and Four factor three level orthogonal experimental design.ResultsThe optimum fermentation formulation: 5.0% corn starch，3.0% soybean powder，0.6% peptone，0.15% potassium nitrate.It was cultured at 33℃ and pH 7.8 for 84h with 25% of inoculation numbers.The product quality conformed to China Pharmacopoeia 2005 (CP2005) and the United States Pharmacopoeia 28 (USP28).ConclusionAfter optimization，the fermentation level of strains 2-25 was greatly improved.

Gentamicin; Micromonmspora purpurea; Fermentation; Orthogonal experiments

R978.1+2

B

1671-8194（2011）33-0247-03