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        液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中4種四環(huán)素族抗生素及其3種差向異構(gòu)體

        2011-10-28 07:31:56劉蓉蓉吳黎明周金慧曾明華
        食品科學(xué) 2011年10期

        劉蓉蓉,吳黎明,周金慧,曾明華*

        (1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,安徽 合肥 230036;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京 100093)

        液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中4種四環(huán)素族抗生素及其3種差向異構(gòu)體

        劉蓉蓉1,2,吳黎明2,周金慧2,曾明華1,*

        (1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,安徽 合肥 230036;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京 100093)

        采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),建立同時測定蜂蜜樣品中4種四環(huán)素族抗生素及其3種差向異構(gòu)體的方法。蜂蜜樣品中殘留的藥物用EDTA-McIlvaine緩沖液提取,提取液依次經(jīng)OASIS HLB及羧酸弱陽離子柱固相萃取柱富集、凈化后,用流動相洗脫。洗脫液經(jīng)微孔濾膜過濾,用流動相甲酸水-乙腈梯度分離,電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜進行測定。在多反應(yīng)監(jiān)測模式下,22min內(nèi)7種藥物基本實現(xiàn)分離以及定性定量。樣品在10~500μg/kg添加范圍內(nèi),回收率均在64.9%~91.0%之間,相對標準偏差(RSD)不大于10.5%。土霉素及差向土霉素、四環(huán)素及差向四環(huán)素的檢測限為1μg/kg,金霉素及差向金霉素、強力霉素的檢測限為2μg/kg。本方法靈敏、可靠,可用于蜂蜜中7種四環(huán)素類抗生素的同時檢測(其中包括3種毒性代謝產(chǎn)物)。

        液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;蜂蜜;四環(huán)素類抗生素;差向異構(gòu)體

        四環(huán)素族抗生素藥物具有廣譜抗菌作用,幾十年來在藥品和食品添加劑中被廣泛應(yīng)用。在養(yǎng)蜂業(yè),被用來防止蜜蜂感染幼蟲腐臭病[1-2],使用較多的有四環(huán)素(tetracycline,TC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、金霉素(chlortetracycline,CTC)、強力霉素(doxycycline,DC)[1]。

        從結(jié)構(gòu)式來看,四環(huán)素族分子中含有酚羥基、烯醇和二甲氨基,屬于酸堿兩性物質(zhì),在強酸堿環(huán)境下不穩(wěn)定。在酸性(pH<2)溶液中,C環(huán)C6位上的仲羥基與C5的氫發(fā)生反式消去形成雙鍵,C11-C11a-C12上雙鍵發(fā)生位移,使碳環(huán)發(fā)生芳構(gòu)化,生成脫水四環(huán)素(ATC)或脫水金霉素(ACTC)。在堿性溶液中,在OH-作用下C6位上的羥基形成氧負離子,進攻分子內(nèi)的C11(羧基碳),經(jīng)電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致碳環(huán)開裂,生成無活性的內(nèi)置異構(gòu)體,稱為異四環(huán)素類。在弱酸性(pH2~6)溶液中[2],由于不對稱碳C4的構(gòu)型改變(圖1),發(fā)生差向異構(gòu)化,反應(yīng)是可逆的,平衡時差向異構(gòu)體的比例可達40%~60%。蜂蜜具有穩(wěn)定的弱酸環(huán)境及17%~19%的水分含量,在加工貯存過程中,蜂蜜中殘留四環(huán)素族抗生素(tetracyclines,TCs)極易發(fā)生代謝,且主要產(chǎn)物為差向異構(gòu)體。四環(huán)素族抗生素差向異構(gòu)體(epitetracycline,ETCs)的藥效極低或消失,但毒副作用增加[3],并且具有在特定環(huán)境下轉(zhuǎn)化回本藥的可能性[3-4]。

        圖1 四環(huán)素差向異構(gòu)化反應(yīng)示圖Fig.1 Epimerization of tetracycline

        對四環(huán)素族抗生素藥物的分離檢測一直是藥物分析中令人關(guān)注的研究課題。對于TCs及其立體異構(gòu)體的分離檢測也已有文章述及[5-8],包括有對于牛奶中,液體豬飼料中。而且國內(nèi)外研究更多只是對母體四環(huán)素的論述。在保健食品行業(yè),蜂蜜產(chǎn)品質(zhì)量倍受關(guān)注,對其中農(nóng)獸藥殘留物的檢測技術(shù)日漸成熟,但對降解產(chǎn)物的毒性研究及殘留測定則少有報道。本實驗在前人工作的基礎(chǔ)上提出了基于高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù),實現(xiàn)對蜂蜜中4種常用TCs(TC、OTC、CTC和DC)及3種代謝物(差向四環(huán)素[epitetracycline,ETC]、差向土霉素[e p i o x y t e t r a c y c l i n e,E O T C]、差向金霉素[epichlortetracycline,ECTC])的同時測定,使得方法滿足蜂蜜中四環(huán)素類抗生素的殘留分析,同時可以對二級有毒代謝產(chǎn)物進行痕量監(jiān)測,更準確的考察出蜂蜜產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素的殘留情況,進而為蜂場合理使用四環(huán)素族抗生素藥物提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試劑與儀器

        TC、OTC、CTC、DC、ETC、EOTC、ECTC對照品 中國藥品生物制品檢定所。對照品標準溶液:準確稱取適量TC、ETC、OTC、EOTC、CTC、ECTC和DC標準品,用甲醇溶解配制成 100mg/L(其中CTC、DC、ECTC為200mg/L)的標準儲備液,于-22℃保存。根據(jù)需要用流動相逐級稀釋成適當質(zhì)量濃度的混合標準工作溶液,混合標準工作溶液在4℃保存,可使用3d。

        0.2mol/L磷酸氫二鈉(優(yōu)級純)溶液、0.1mol/L檸檬酸溶液、Mcllvaine緩沖溶液pH5.0±0.05、0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖乙腈、乙酸乙酯、甲醇和甲酸銨(均為色譜純);其余未注明為分析純;水為Millipore超純水。

        6460A 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(配有Jet Stream噴霧電離源)、 ZORBAX SB-C18液相色譜柱(2.1mm×50mm,1.8μm) 美國安捷倫公司;Oasis HLB小柱(500mg,6mL)(使用前分別用 5mL甲醇和 10mL水預(yù)處理,保持柱體濕潤) 美國Waters公司;Supelclean LC-WCX SPE 小柱(500mg,3mL)(使用前用5mL乙酸乙酯預(yù)處理)、固相萃取裝置 美國Supelco公司;CR22G高速離心機 日本Hitachi公司;QB-210試管旋轉(zhuǎn)搖床 江蘇海門其林貝爾公司;N-EVAP 112氮吹儀 德國OA-SYS公司;JA2003電子天平(0.001g) 上海楚定科技公司;FE20pH計 瑞士Mettler-Toledo公司。

        1.2 樣品前處理

        1.2.1 提取

        準確稱取 6.0g待測蜂蜜樣品(精確至0.01g)于50mL離心管中,加入30mL 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH5),手搖萃取5min后,在12000r/min下離心5min,取上清液待凈化。如果遇到蜂蜜樣品結(jié)晶,在低于60℃水中加熱使其完全溶解,混勻后再稱樣。

        1.2.2 凈化

        將離心管中上清液倒入下接Oasis HLB固相萃取柱的貯液器中,使上清液以小于等于3mL/min的流速通過Oasis HLB固相萃取柱,用5mL甲醇-水(5:95,V/V)淋洗去除柱內(nèi)雜質(zhì)后,在65kPa負壓下減壓抽干30min。最后取15mL乙酸乙酯洗脫并將洗脫液通過預(yù)先活化的羧酸陽離子柱,用5mL甲醇淋洗后,減壓抽干5min。再用4mL流動相洗脫收集洗脫液于樣品管中,并用流動相定容至4mL,待測。

        1.3 分析條件

        色譜條件:色譜柱:ZORBAX SB-C18(2.1mm×50mm,1.8μm);流動相:A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈,梯度洗脫程序:見表1。流速:0.3mL/min;進樣量:5μL;柱溫:3 0℃。

        表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution table

        質(zhì)譜條件:霧化氣、脫溶劑氣、錐孔氣為氮氣,碰撞氣為高純氮氣。霧化氣壓力45psi;鞘氣溫度:350℃;鞘氣流量10L/min;干燥氣溫度350℃;干燥氣流量6L/min;噴嘴電壓1000V;毛細管電壓4000V;電離方式:ESI+;采集方式:MRM;駐留時間30ms;掃描范圍m/z 100~600。定性離子對、定量離子對和碰撞氣能量見表2。

        表2 7種四環(huán)素類藥物的質(zhì)譜分析條件Table 2 ESI-MS/MS analysis conditions of tetracyclines

        2 結(jié)果與分析

        2.1 前處理條件優(yōu)化

        圖2 四環(huán)素族抗生素測定的主要前處理步驟Fig.2 Pre-treatment procedures for the determination of tetracyclines

        2.1.1 提取條件的優(yōu)化

        四環(huán)素抗生素在醇類中的溶解度較大[22],在乙酸乙酯、丙酮、乙腈等有機溶劑中溶解度較小,在水中溶解度在mg/mL水平。由于TCs中活性基團眾多,易與金屬離子形成配合物,又可以與生物樣本中的蛋白鍵合,所以樣品提取時需加入金屬絡(luò)合劑和強酸或酸性去蛋白試劑,但四環(huán)素溶液在pH<2時可發(fā)生脫水反應(yīng)物,因此用含有金屬絡(luò)合劑的弱酸作為提取液,包括草酸及Mcllvaine。首先考慮到鹽類緩沖溶液在質(zhì)譜體系中造成毛細管接口聚集可損害質(zhì)譜壽命[23],采用0.1mol/L Na2EDTA- McIlvaine緩沖液作為提取液,回收率最好。

        為了考察提取液pH值對回收率的影響,分別配制pH2.5~6.0的Na2EDTA- McIlvaine緩沖液,對標準添加蜂蜜進行提取、凈化,計算回收率,比較提取效果。

        表3 提取液pH值對回收率的影響(n=6)Table 3 Effect of pH on recovery rate(n=6)%

        從表3可以看出,當pH5.0時,其回收率較好。因此,本方法選擇pH 5.0的0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液做為提取液。在此弱酸環(huán)境下,緩沖液當天提取時形成的差向四環(huán)素類可以忽略,并且在-20℃避光保存3d穩(wěn)定[24],不影響測定方法重現(xiàn)性。

        2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

        蜂蜜基質(zhì)成分復(fù)雜,尤其是相對肉制品,飼料等。由于共流物可能造成嚴重的基質(zhì)效應(yīng),影響分析物的電離效應(yīng),比如說糖類、鹽類、蛋白質(zhì)類、脂質(zhì)。本實驗采用了OASIS HLB固相萃取柱及離子交換萃取柱兩次固相萃取操作對樣品充分凈化,其標準溶液的柱回收率都很高,且重現(xiàn)性良好。

        對于Oasis HLB固相萃取柱,對比乙腈、甲醇、甲醇-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯,等各種洗脫劑的效果。甲醇、乙腈洗脫能力較強,容易洗下過多雜質(zhì),15mL乙酸乙酯可以滿足回收率及凈化條件。對于羧酸弱陽離子柱使用流動相作洗脫劑,洗脫效果令人滿意,省去濃縮復(fù)溶環(huán)節(jié),直接上機。因此,本方法選用流動相作為羧酸離子柱的洗脫劑,洗脫劑用量對回收率的影響見表4。

        表4 洗脫劑用量對回收率的影響(n=6)Table 4 Effect of eluent amount on recovery rate (n=6)%

        從表4可以看出,使用羧酸離子柱,用4mL流動相洗脫,可獲得理想的凈化富集效果。

        2.2 儀器分析條件的優(yōu)化

        文獻中報道的高效液相分離方法中,多采用反向分離柱,流動相多為甲醇、乙腈及草酸溶液。使用ZORBAX SB-C18(2.1mm×50mm,1.8μm),0.1%甲酸-乙腈流動相梯度洗脫,除差土霉素和差向四環(huán)素不能完全分離外,其余可以達到較好的基線分離。

        在質(zhì)譜分析中,首先在一級全掃描質(zhì)譜中得到TCs的準分子離子峰,確定母離子[M+H]+,再選擇[M+H]+進行二級質(zhì)譜分析。通過優(yōu)化碰撞能,選擇子離子中相對豐度較大的特征離子作為優(yōu)化后定性離子對、定量離子對。準分子離子可生成的主要碎片離子為[M+H-NH3]+和[M+H-NH3-H2O]+,丟失的NH3來自圖1中第4個環(huán),丟失的H2O來自第2個環(huán)。色譜條件下未分離的差向土霉素和差向四環(huán)素通過監(jiān)測離子在MRM模式下仍然不影響分別定量。

        2.3 定性定量分析

        圖3 標樣定性、定量離子的MRM圖(100μg/L)Fig.3 MRM chromatogram of standard sample at the concentration of 100μg/L and blank sample spiked with TC and ETC at the concentration of 100μg/L

        圖4 空白添加樣(10μg/kg)的定性離子和定量離子MRM圖Fig.4 MRM Chromatogram of negative sample spiked with TCs and ETCs (10μg/kg)

        按照1.3節(jié)所述方法分別對單標溶液(添加水平分別為100μg/L)進行全掃描,根據(jù)子離子相對豐度選擇定性定量離子。按照1.2節(jié)述及方法對空白蜂蜜樣品及添加TCs及ETCs后的空白蜂蜜中樣品進行測定。其總離子流色譜圖及提取離子色譜圖見圖3、4,未添加TCs及ETCs的空白蜂蜜樣品的色譜圖略)。

        2.4 標準曲線

        用流動相將各藥物標準儲備液稀釋成TCs、ETCs濃度分別為4、40、200、400、600、800、1000μg/L的系列混合標準溶液,在1.2節(jié)條件下,以藥物的質(zhì)量濃度/(μg/L)為橫坐標(x),以其峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸。結(jié)果見表5。

        表5 7種四環(huán)素類抗生素校正曲線的回歸分析Table 5 Regression analysis for calibration curves of 7 tetracyclines

        2.5 檢測限與定量限

        檢測限:添加1mg/L標準溶液60μL于6g空白蜂蜜樣品中(即添加水平為10μg/kg),經(jīng)提取、凈化后測定,OTC、EOTC、TC、ETC的信噪比(RSN)大于30,CTC、ECTC和DC的RSN大于15,根據(jù)檢出限含量處的RSN等于3的原則,計算方法的檢測限分別為1μg/kg和2μg/kg。

        定量限:添加1mg/L標準溶液150μL于6g空白蜂蜜樣品中(即添加水平為25μg/kg),經(jīng)提取、凈化后測定,OTC、EOTC、TC、ETC的RSN大于90,CTC、ECTC和DC的RSN大于45,根據(jù)定量限含量處的RSN等于10的原則,方法的定量限分別為3.3μg/kg和6.7μg/kg。

        2.6 回收率實驗

        取空白蜂蜜樣品添加TCs、ETCs藥物標準溶液適量,制得10、50、500μg/kg(即1/2的最高殘留限量[maximum residue limits for veterinary drugs,MRLVDs]、MRLVDs和2倍的MRLVDs)3個水平的標準添加蜂蜜樣品,進行回收率實驗(每個水平下做6個平行實驗),結(jié)果見表6。樣品在10~500μg/kg添加范圍內(nèi),回收率均在64.9%~91.0%之間(差向異構(gòu)體水溶性較高,提取凈化環(huán)節(jié)的回收率較低),相對標準偏差(RSD)不大于10.5%。

        表6 TCS和ETCs回收率和精密度實驗結(jié)果(n=6)Table 6 Recovery rates of oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline in honey (n=6)%

        2.7 實際樣品的測定

        應(yīng)用本方法測定了來自不同地區(qū)的34個蜂蜜樣品,其中一個蜂蜜樣品檢出有10-9級四環(huán)素及差向物殘留 (分別為5.4、4.9μg/kg),一個有土霉素及差向物殘留(分別為10.6、3.8μg/kg),表明商品蜜中殘留四環(huán)素確實在蜂蜜的加工儲存上架期內(nèi)發(fā)生差向異構(gòu),殘留檢測和危害分析工作中應(yīng)該納入差向代謝物。

        3 結(jié) 論

        在樣品凈化時采用OASIS HLB固相萃取柱和羧酸型弱陽離子交換柱凈化,同時對其他分析參數(shù)做了進一步優(yōu)化,改進了凈化效果。從而提高了方法的靈敏度(檢測限達到1~2μg/kg),增加了方法的穩(wěn)定性(RSD≤10.5),提高了樣品回收率(64.9%~91.0%)。在對不同地區(qū)的不同樣品分析時,陽性樣品的分析值穩(wěn)定,空白樣品標準添加回收率實驗及精密度實驗顯示方法定量準確,重現(xiàn)性好,可以作為實際樣品中四環(huán)素及其差向物殘留測定項目的分析方法,并取得滿意效果。

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        Simultaneous Determination of 4 Tetracyclines and 3 Epimers in Honey by HPLC Coupled with Tandem MS

        LIU Rong-rong1,2,WU Li-ming2,ZHOU Jin-hui2,ZENG Ming-hua1,*
        (1. School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;
        2. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

        A method for simultaneous determination of 4 tetracyclines and 3 epimers in honey samples was developed by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. The residues in honey samples were extracted by EDTA-Mcllvaine buffer, and cleaned up and condensed by OASIS hydrophilic-liphophilic balance (HLB) column and weak cation exchange (WCX and carboxylic acid) sequentially. Sample solution eluted from the WCX SPE column by mobile phase was filtered by micro-pours membrane, separated by LC-MS/MS with gradient elution using acetonitrile-formic acid solution as mobile phase and then qualitatively and quantitatively analyzed by ESI-MS/MS in a MRM mode. Baseline separation of 7 target drugs was achieved within 7 min, and qualitative and quantitative analysis was completed. The recovery rates of the spiked samples at trace levels were in the range of 64.9% to 91.0% with the relative standard deviation (RSD) less than 10.5%(n = 7). The detection limits were 1μg/kg for oxytetracycline, tetracyclines, 4-epitetracycline, 4-epioxytetracycline and 2 μg/kg for chlortetracycline, doxycycline and epichlortetracycline. The developed method was sensitive and reliable, and can be successfully applied to the simultaneous detection of 7 target tetracyclines residues including toxic metabolites in honey.

        high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;honey;tetracyclines;epimers

        TS252.1

        A

        1002-6630(2011)10-0232-05

        2010-11-04

        國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(nycytx43-kxy9)

        劉蓉蓉(1985—),女,碩士研究生,研究方向為動物源性食品安全。E-mail:liurongrong9301@yahoo.com.cn

        *通信作者:曾明華(1956—),男,副教授,碩士,研究方向為獸醫(yī)藥理學(xué)和動物毒理學(xué)。E-mail:zmhzmh@ahau.edu.cn

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