張愛芝，王全林*

(寧波市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，浙江 寧波 315041)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析測定食用植物油中痕量Δ9-四氫大麻酚

張愛芝，王全林*

(寧波市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，浙江 寧波 315041)

以電噴霧離子源(ESI)為電離源，在負離子采集模式下建立食用植物油中Δ9四氫大麻酚(Δ9-THC)超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測方法。實驗以甲醇為提取劑，經(jīng)中性氧化鋁固相萃取柱凈化、Waters ACQUITYTMUPLC BEH-C18(2.1mm×100mm，1.7μm)色譜柱分離后以UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式進行分析。方法檢出限和定量限分別為0.15μg/kg和0.45μg/kg。實驗以Δ9-氘代四氫大麻酚(Δ9-THC-D3)為內(nèi)標物，采用內(nèi)標法定量。3個添加水平，平均回收率為68.0%～110.0%，相對標準偏差為8.8%～18.1%。本方法能夠滿足食用植物油中Δ9-四氫大麻酚痕量檢測的要求。

食用植物油；Δ9-四氫大麻酚；超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜；負離子模式

Δ9-四氫大麻酚(delta 9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC)，主要來源于大麻，是精神活性物質(zhì)，對中樞神經(jīng)有明顯作用，并可產(chǎn)生依賴成癮性。高含量的THC相關(guān)的物質(zhì)在全球范圍內(nèi)被定性為毒品。我國纖用大麻種植面積高達成千上萬畝，作為副產(chǎn)物，大麻籽經(jīng)常被用來榨油，但由于大麻籽油中含有四氫大麻酚，我國食用植物油標準體系[1]將大麻油列為非食用油的范疇，并禁止將其摻雜到其他食用油中。然而，為了追求經(jīng)濟利益，未經(jīng)處理、含有四氫大麻酚的大麻仁油會被不法的生產(chǎn)商摻入食用植物油中。食用植物油衛(wèi)生標準[2]鑒別食用植物油中是否摻雜有大麻油的標準方法是以Δ9-四氫大麻酚為特征指標，采用薄層色譜法進行分析檢測。薄層色譜法操作繁瑣，并且胡麻油、芝麻油和牢固藍鹽B會干擾測定，容易出現(xiàn)假陽性，給食品安全監(jiān)管造成困難。因此，開發(fā)靈敏、可靠的測定食用植物油中Δ9-THC的檢測技術(shù)，對于保障人民身體健康具有重要意義。

目前，國內(nèi)外有關(guān)Δ9-THC檢測方法的研究主要集中在毒品吸食者、試驗動物的血液、尿液、唾液等生物樣品[3-10]。大麻籽及其油品中Δ9-THC檢測方法研究報道的主要有氣相色譜及液相色譜法[11-14]。然而，因摻雜了大麻油的食用植物油中Δ9-THC含量相對較低，這些方法難以滿足測定靈敏度的要求。本實驗建立食用植物油中分析測定Δ9-THC的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，該法操作簡便、分析時間短、檢出限低，可用于摻雜有大麻籽油的食用植物油中Δ9-THC的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆油 上海市購。

甲醇(色譜純) 德國Merck公司；實驗用水均為超純水(Millipore公司超純水器制備，電阻率為18.2MΩ·cm)。Δ9-四氫大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC，1.0mg/mL)標準品 中國藥品生物制品檢定所；氘代四氫大麻酚(Δ9-THC-D3，100μg/mL) 美國Cerilliant公司。

標準工作溶液的配制：以體積分數(shù)87%的甲醇溶液配制Δ9-四氫大麻酚標準工作溶液，每一標準工作溶液中內(nèi)標物Δ9-氘代四氫大麻酚質(zhì)量濃度均為10ng/mL。

ACQUITYTM超高效液相色譜儀、Quattro Premier XE質(zhì)譜儀 美國Waters公司；超聲波清洗器 寧波海曙超聲儀器公司；TG16-WS 高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SC-8L-150數(shù)控固相萃取儀 廣州智真生物科技有限公司；氮吹儀 上海安譜儀器公司。SupelcleanTMLC-Alumina-N 固相萃取柱(1g/3mL) 美國Supelco公司。

1.2 UPLC-MS/MS分析條件

超高效液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；柱溫：40℃；樣品溫度：20℃；進樣體積：10μL。流動相A為水，流動相B為甲醇，實驗采用87% B－13% A等度洗脫。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離(ESI－)；毛細管電壓：3.50kV；射頻透鏡1(RFlens 1)和射頻透鏡2(RF lens 2)的電壓分別為15.0V和13.0V；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流量：600L/h。采用MRM監(jiān)測模式，優(yōu)化采集參數(shù)見表1，帶下劃線的離子為定量離子。

表1 Δ9-THC和Δ9-THC-D3的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MS parameters for THC and THC-D3

1.3 試樣前處理

稱取1.00g食用植物油，準確至0.01g，置于10mL具塞塑料離心管中，加入50μL質(zhì)量濃度為1μg/mL的Δ9-THC-D3大麻酚標準溶液(用于加標回收實驗的樣品，加入一定量的標液)，5mL甲醇，超聲提取10min，8000r/min離心3min，吸取上清液于50mL小燒杯中，提取過程重復(fù)3次，在不高于40℃條件下N2吹至約0.5mL。5mL石油醚溶解，待凈化。

SupelcleanTMLC-Alumina-N固相萃取柱(Supelco 1g/3mL)以3mL石油醚活化平衡。將小燒杯中的試液全部上柱并接收上柱液，而后石油醚洗脫，共接收石油醚40mL，洗脫液于40℃條件N2吹干。加入5mL體積分數(shù)87%的甲醇溶液，超聲溶解30s，過0.2μm濾膜，上機分析。

1.4 測定

定性需滿足：1)空白樣品中不出現(xiàn)與陽性對照相同的離子峰；2)特征離子色譜峰的信噪比(RSN)都在3:1以上；3)試樣色譜峰的保留時間，應(yīng)與校正溶液的相對保留時間一致，容許偏差為±2.5%；4)檢測到的離子的相對豐度與校正溶液的相對豐度一致，容許偏差滿足2002/657/EC中的要求。本實驗采用內(nèi)標法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的確定

長期以來，我國對于養(yǎng)老服務(wù)機構(gòu)的認識局限于只能是非營利性，非企業(yè)性，政策支持上自然也僅限于此。雖然近年我國開始轉(zhuǎn)變觀念，政策上允許并鼓勵支持營利性養(yǎng)老服務(wù)機構(gòu)的建設(shè)和發(fā)展，但許多職能部門的觀念并沒有及時調(diào)整和轉(zhuǎn)變過來，從而造成國家與地方之間、部門與部門之間在政策上、做法上還有許多的不統(tǒng)一，某些基層部門常以上級部門還未發(fā)文為由延緩或阻礙政策的執(zhí)行，一定程度上阻礙了營利性養(yǎng)老服務(wù)機構(gòu)的建設(shè)與發(fā)展。

2.1.1 提取劑的確定

Δ9-THC的提取多采用甲醇和乙腈為提取劑[3,13,15-17]，實驗考察兩種提取劑對目標物提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論采用哪種提取劑，都存在一定的基質(zhì)干擾，以基質(zhì)匹配單點法定量，兩者提取效果無明顯差異。實驗選用甲醇為提取劑。

2.1.2 提取方法的確定

已見報道的Δ9-四氫大麻酚檢測的提取方法主要有4種：取少量樣品直接以甲醇溶解后進行分析[15]、傳統(tǒng)液液萃取[16]、超聲波萃取[13]、堿性水解后再進行提取[17]等方法。比較了各提取方式對回收率的影響。直接溶解分析方法檢出限較高，不能滿足痕量殘留檢測的需要；分液漏斗進行液液萃取回收率較低，且需大量有機溶劑；堿性水解后再進行提取方法操作繁瑣且過程中會有部分Δ9-四氫大麻酚分解損失；比較而言，超聲波萃取方法簡單且回收率較高，因而本實驗選用超聲波提取方式進行。

2.1.3 固相萃取凈化柱的選擇

痕量或殘留分析中，采取固相萃取技術(shù)對分析液進行凈化已成為分析者普遍采用的技術(shù)。已見報道的分析測定四氫大麻酚文獻中采用的固相萃取凈化小柱有C18[3]、Bond Elute Certify Ⅱ[18]及 LC-Alumina-N[12]。實驗研究了Δ9-THC在3種柱子上的保留行為，發(fā)現(xiàn)Δ9-THC在 C18及LC-Alumina-N柱上的保留較強，在CertifyⅡ柱上的保留相對較弱?？疾炝?種固相萃取小柱對分析液凈化效果的影響(以分析液中Δ9-THC響應(yīng)強度衡量)，由圖1可以看出，LC-Alumina-N 固相萃取小柱的凈化效果較好。

圖1 不同固相萃取小柱凈化效果圖Fig.1 Clean-up efficiency of different SPE columns

2.1.4 LC-Alumina-N過柱條件的優(yōu)化

圖2 不同洗脫劑對Δ9-THC回收率的影響Fig.2 Effect of eluent on recovery rate of THC

2.2 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 電離模式的選擇

從Δ9-THC的分子結(jié)構(gòu)來看，結(jié)構(gòu)本身既含有酚羥基又在環(huán)結(jié)構(gòu)中含有氧，這表明Δ9-THC可能既可以采用正離子電離模式也適合采用負離子采集模式進行分析，但目前基本上所有有關(guān)分析測定Δ9-四氫大麻酚的文獻都是采用正離子采集模式進行分析的[4,10]。實驗詳細考察兩種電離模式對目標化合物靈敏度的影響。在甲醇-水流動相體系下，實驗同時采用正離子模式及負離子模式對Δ9-四氫大麻酚進行了采集，發(fā)現(xiàn)用負離子模式進行采集，Δ9-四氫大麻酚母離子較穩(wěn)定且響應(yīng)強度較高，因而實驗選用負離子電離模式。

2.2.2 流動相的選擇與優(yōu)化

流動相的組成不僅會影響到目標化合物的保留時間和峰形，最重要的是還會影響到目標化合物的離子化效率，從而最終影響靈敏度。液質(zhì)聯(lián)用采用的流動相的基礎(chǔ)體系是甲醇-水及乙腈-水體系。為提高離子化效率，在采用負離子電離模式時通常選用乙腈-水體系。實驗考察兩種流動相體系對目標化合物響應(yīng)靈敏度的影響，發(fā)現(xiàn)在兩種流動相體系下目標物的響應(yīng)強度相差不大，實驗采用以甲醇-水作為流動相并詳細優(yōu)化了洗脫梯度，結(jié)果表明用體積分數(shù)87%的甲醇溶液等度洗脫時，5min內(nèi)即可完成對Δ9-四氫大麻酚的分析測定。圖3是在選定的實驗條件下，同一標準溶液連續(xù)進樣6次Δ9-四氫大麻酚和Δ9-氘代四氫大麻酚的總離子流圖疊加圖，6次的變異系數(shù)為3.3%，表明在優(yōu)化條件下，測定方法穩(wěn)定。圖4是Δ9-四氫大麻酚和氘代四氫大麻酚標準溶液的MRM色譜圖。依據(jù)選定的實驗方法，測試陰性空白大豆食用油樣品提取測試液(圖5，圖中箭頭標示的出峰位)和陰性加標樣品提取測試液(圖6，加標2.0μg/kg)中目標物的MRM色譜圖?？梢钥闯?，Δ9-四氫大麻酚在實際樣品測定中不受復(fù)雜的樣品基質(zhì)的干擾。

圖3 Δ9-四氫大麻酚和Δ9-氘代四氫大麻酚的總離子流圖疊加圖(n=6)Fig.3 Stability of the developed method (n=6)

圖4 標準溶液MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of standard solutions of THC-D3 and THC

圖5 空白樣品MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatogram of blank sample

圖6 加標樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of the spiked sample with THC at the concentration of 2.0μg/kg

2.3 檢出限、定量限

采用向陰性樣品中逐級降低加標濃度的方法來確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。以3倍信噪比(RSN=3)對應(yīng)的目標物濃度作為檢出限，以10倍信噪比(RSN=10)對應(yīng)的目標物濃度作為定量限，得到Δ9-THC的方法檢出限和定量限分別為0.15μg/kg 和0.45μg/kg。

2.4 校準曲線、回收率及精密度

配制Δ9-THC質(zhì)量濃度為0.5～40.0μg/L的系列標準溶液，內(nèi)標物Δ9-THC-D3質(zhì)量濃度恒定為10μg/L以Δ9-THC的定量離子色譜峰面積與Δ9-THC-D3的定量離子色譜峰面積之比(Y)為縱坐標、分析物標準溶液濃度(X)為橫坐標做標準曲線，標準曲線為Y=0.109564X＋0.00935539，R2=0.996581，大于0.99，截據(jù)斜率之比小于0.1，表明Δ9-THC在質(zhì)量濃度0.5～40.0μg/L內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，且無背景干擾。

添加水平為0.50、2.00μg/kg及10.00μg/kg時的回收率及精密度見表2。由數(shù)據(jù)可以看出，Δ9-THC在3種加標水平下平均回收率為68.0%～110.0%，相對標準偏差為8.8%～18.1%，能夠滿足殘留檢測需要。

表2 不同添加水平下THC的加標回收率、相對標準偏差(n=6)Table 2 Average recovery rate and relative standard errors of THC at different spiked levels (n=6)

3 結(jié) 論

本實驗建立了UPLC-MS/MS法測定食用植物油中痕量Δ9-THC的分析方法。實驗系統(tǒng)考察了提取劑、提取方法、凈化方法對測定結(jié)果的影響，確定了甲醇超聲提取、中性氧化鋁固相萃取小柱凈化富集的前處理方法；詳細優(yōu)化超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(UPLC-MSMS)法的儀器條件，比較了正、負電離模式對Δ9-THC響應(yīng)靈敏度的影響，在負離子采集模式下以多反應(yīng)檢測模式進行分析；在3個添加水平下對食用植物油中的Δ9-THC進行檢測，以內(nèi)標法定量，平均回收率為68.0%～110.0%。本方法操作簡便、分析時間短、檢出限低，有一定的實際應(yīng)用價值。

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Determination of THC in Edible Vegetable Oil by Ultra-high Performance Liquid Chrmatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Ai-zhi，WANG Quan-lin*
(Ningbo Academy of Product Quality Supervision and Inspection, Ningbo 315041, China)

A determination method for Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) in edible vegetable oil was developed on the basis of ultra-high performance liquid chrmatography-electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) under negative ion mode using electrospray ionization (ESI) source. THC was extracted with methanol and then purified by LC-alumina-N solid phase extraction column. Qualitative and quantitative analysis were carried out for the analyte under a MRM mode after THC was separated on Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18 (1.7 μm, 2.1 mm×100 mm) column. The limit of detection (LOD) of the developed method was 0.15 μ g/kg and the limit of quantification (LOQ) was 0.45 μ g/kg for THC. Quantitative analysis was corrected by internal standard method using delta 9-THC-D3 as internal standard. Average recovery rate of THC varied from 68.0%－110.0% with relative standard deviation ranging from 8.8%－18.1% at three spiked levels. Therefore, the developed method meets the requirements for the determination of THC in edible vegetable oil.

edible vegetable oil；Δ9-Tetrahydrocannabinol；ultra-high performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)；negative ion mode

TS201；O657

A

1002-6630(2011)10-0194-05

2010-07-21

浙江省質(zhì)檢系統(tǒng)科研計劃項目(20080228)

張愛芝(1981—)，女，碩士，主要從事食品安全檢測技術(shù)研究。E-mail：zhangaizhi1981@163.com

*通信作者：王全林(1962—)，男，教授級高級工程師，博士，主要從事食品安全檢測技術(shù)及標準化研究。E-mail：quanlinwang@163.com