肖維強(qiáng)，黃桂穎，戴宏芬，陳悅嬌，黃炳雄，馬應(yīng)丹，王曉容,*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣東 廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225)

RP-HPLC法測定水果中的蛇麻醇酯

肖維強(qiáng)1，黃桂穎2，戴宏芬1，陳悅嬌2，黃炳雄1，馬應(yīng)丹2，王曉容1,*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣東 廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225)

應(yīng)用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)建立蛇麻醇酯簡便的分析方法。分析條件為：色譜柱Nucleosil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相A為甲醇和水(甲醇:水=20:80)，用體積分?jǐn)?shù)50%的磷酸調(diào)pH值至3.2±0.05，流動(dòng)相B為甲醇(含0.01%的磷酸)，A:B=4:96，流速1.2mL/min，檢測波長為210nm，柱溫40℃。蛇麻醇酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線為5～250μg/mL 7個(gè)治療質(zhì)量濃度梯度，y=4.6068x＋11.2640，R2=0.9992。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果：連續(xù)5次進(jìn)樣，保留時(shí)間 RSD為0.2107%，峰面積的RSD為1.2843%；同一樣品，在0～48h內(nèi)9次進(jìn)樣，保留時(shí)間的RSD為0.3383%，峰面積的RSD為1.9737%。準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果：回收率為94.971%～101.964%，回收率的RSD為2.5825%。儀器的最低檢出限為1.8886μg/mL。被測定的幾種水果(青果、草莓、香蕉、巨峰葡萄、美國紅提、番木瓜)中，以青果(干粉)中含量最高，達(dá)359μg/g以上。本研究建立的分析條件，能滿足水果等樣品中蛇麻醇酯定性定量分析的需要。

反相高效液相色譜法(RP-HPLC)；蛇麻醇酯；水果

蛇麻醇酯(lupeol)，別名羽扁豆醇、羽扁醇等，屬三萜系化合物，由于在羽扁豆(Lupinus luteus)種子中存在而得名[1]。據(jù)報(bào)道：蛇麻醇酯存在于許多種水果和藥用植物中，如白色甘藍(lán)、綠胡椒、草莓、橄欖、芒果、葡萄等[2]；蛇麻醇酯對鼠皮過氧化苯甲酰誘導(dǎo)的皮膚癌具有有效的抑制作用[3]；可阻斷前列腺癌細(xì)胞中生存素(survivin/cFLIP)的激活，抑制來源于人類雄性激素的腫瘤的生長，有可能作為其他微管劑的輔助劑，發(fā)展成為一種人類CaP治療的潛在劑[4]；蛇麻醇酯可減少人體肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中甘油三酯和膽固醇的合成[5]，蛇麻醇酯和它的酯化派生物對血膽脂醇過多誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化和發(fā)炎具有治療作用[6]；蛇麻醇酯在瑞士白化變種鼠中由DMBA 引起的DNA烷化損害上具有預(yù)防作用[7]；蛇麻醇酯在體內(nèi)和體外系統(tǒng)中還顯示出了一些生物活性，如抗炎、治風(fēng)濕、抗誘變、抗變、抗瘧等，為一個(gè)強(qiáng)有力的抗腫瘤劑，已發(fā)現(xiàn)的大量高活性的派生物顯示出更強(qiáng)的效力和更好的治療指數(shù)，證實(shí)了蛇麻醇酯的化學(xué)預(yù)防前景并揭示了潛在的化學(xué)預(yù)防靶標(biāo)，主要是細(xì)胞周期調(diào)解途徑基因，并設(shè)法解釋作用后的運(yùn)作機(jī)制[8]。因此，蛇麻醇酯是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)有力的抗癌物質(zhì)，有關(guān)此物質(zhì)的反相高效液相色譜分離及在水果和蔬菜中的定性定量測定，國內(nèi)外少報(bào)道。Mathe等[9]曾報(bào)道過用HPLC法測定了15種三萜系化合物，分離時(shí)間達(dá)70min；Martelanc等[10]應(yīng)用HPLC/MS等方法測定了白色甘藍(lán)中的蛇麻醇酯，并建立了較簡便快捷的分離方法。本實(shí)驗(yàn)在蛇麻醇酯的反相高效液相色譜法(reverse-phase highperformance liquid chromatography，RP-HPLC)分離[11]基礎(chǔ)上，擬建立蛇麻醇酯的簡便分析方法，用于樣品中蛇麻醇酯含量的快速測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

橄欖(又名青果，品種：八枝香)，取自廣東省普寧市成熟期果實(shí)；番木瓜采自廣州市郊，成熟期(三劃黃)的果實(shí)，品種為穗中紅；草莓、香蕉、芒果、葡萄等均市售水果。

蛇麻醇酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號為049K0996) 美國Sigma公司；甲醇(色譜級) 德國Merck公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為自制雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀(配Agilent化學(xué)工作站和DAD檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器) 美國Agilent公司；分離柱(填料為Nucleosil C18反相柱，250mm×4.6mm，5μm，卡套柱) 德國Macherey-Nagel公司。

1.3 樣品前處理

將青果、番木瓜、草莓、香蕉、芒果、葡萄等去核(或者皮)，切成小塊，于65℃烘箱中烘干后打粉，60%以上過60篩目，其余顆粒直徑在1mm左右為宜，65℃烘至質(zhì)量恒定，保存于干燥器中。

1.4 樣品中蛇麻醇酯的提取

各樣品中蛇麻醇酯的提取按文獻(xiàn)[9]和[11]進(jìn)行，分別稱取各樣品干粉2g左右于25mL容量瓶中，加入甲醇15mL浸泡12～18h，超聲波提取30min，用甲醇定容，充分混勻后取上清液經(jīng)0.5μm的微孔膜過濾后上機(jī)分析，均重復(fù)3次。

1.5 RP-HPLC條件

蛇麻醇酯的RP-HPLC分析條件按參考文獻(xiàn)[11]的方法并加以改進(jìn)。色譜柱為Nucleosil C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相A：甲醇-水(甲醇:水=20:80，V/V)，用體積分?jǐn)?shù)50%的磷酸調(diào)pH值至3.2±0.05，流動(dòng)相B：甲醇(含0.01%的磷酸)，A:B＝4:96；流速1.2mL/min；檢測波長為210nm；柱溫40℃。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將蛇麻醇酯標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相溶解，配制成最高含量為250μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后逐級稀釋，分別為200、150、100、50、10、5μg/mL 7個(gè)質(zhì)量濃度梯度。按1.5節(jié)色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣量為20μL。根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，經(jīng)Excel計(jì)算，得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(R2)。

1.7 精密度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

選擇200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)5次進(jìn)樣，和在0～48h內(nèi)多次進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為20μL。對0、1、2、4、9、12、24、36、48h共9個(gè)點(diǎn)的分析結(jié)果，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.8 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

參照戴宏芬等[12]的方法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)。按1.4節(jié)方法，稱取青果干粉1g于10mL容量瓶中，加入最終質(zhì)量濃度50μg/mL的蛇麻醇酯標(biāo)準(zhǔn)品，以不加標(biāo)準(zhǔn)品的青果樣品和50μg/mL的蛇麻醇酯為參照，樣品的處理方法同1.4節(jié)。根據(jù)峰面積計(jì)算回收率和回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.9 儀器最低檢出限

根據(jù)儀器提供的軟件，計(jì)算儀器的最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛇麻醇酯標(biāo)準(zhǔn)品的分離

圖1 蛇麻醇酯標(biāo)準(zhǔn)品RP-HPLC圖Fig.1 RP-HPLC of standard lupeol

按1.5節(jié)中的RP-HPLC條件，蛇麻醇酯標(biāo)準(zhǔn)品的分離圖如圖1所示。蛇麻醇酯標(biāo)準(zhǔn)品在RP-HPLC條件下得到了良好的分離，在波長210nm時(shí)，能與其他雜質(zhì)分開，保留時(shí)間為12.808min。

2.2 蛇麻醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.6節(jié)中7個(gè)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度梯度，經(jīng)計(jì)算，5～250μg/mL線性關(guān)系良好，蛇麻醇酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 4.6068x＋11.2640，R2=0.9992。

2.3 儀器精密度及標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性結(jié)果

選擇200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)5次進(jìn)樣，其保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.2107%，峰面積的RSD為1.2843%。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多次進(jìn)樣其保留時(shí)間的RSD為0.3383%，峰面積的RSD為1.9737%。上述結(jié)果說明儀器穩(wěn)定且精密度高，標(biāo)準(zhǔn)品在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery rate experiments

由表1可見，樣品的回收率為94.971%～101.964%，平均回收率為98.397%，回收率的RSD值為2.5825%，此結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)分析方法可靠。

2.5 儀器最低檢出限

本儀器對蛇麻醇酯的最低檢出限為1.8886μg/mL(RSN=2)，能滿足儀器條件對樣品分析的要求。

2.6 多種水果中蛇麻醇酯含量的RP-HPLC測定

圖2 青果中蛇麻醇酯的RP-HPLC圖Fig.2 RP-HPLC of lupeol in Chinese olive

根據(jù)上述所設(shè)定的分析條件和樣品的處理方法，被測定的幾種水果中蛇麻醇酯的含量(以干粉計(jì)算)分別為青果(八枝香)359μg/g以上、草莓298μg/g、香蕉92μg/g、巨峰葡萄8μg/g、美國紅提9μg/g、番木瓜(穗中紅)70 μg/g以上，以青果中含量最高，其次是草莓，芒果含量最少。青果干粉中蛇麻醇酯RP-HPLC分離圖譜見圖2。樣品中的蛇麻醇酯基本能與其他雜質(zhì)分開，并能積分做定量分析。

3 討論與結(jié)論

蛇麻醇酯是近幾年來人們發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)抗癌作用的一種天然三萜系化合物，存在多種水果、蔬菜和藥用植物中[2-3,5]。據(jù)中國香港大學(xué)一項(xiàng)研究成果(2007年10月17日文滙報(bào)美洲版)報(bào)道：“一種蔬果中天然含有的物質(zhì)-蛇麻醇酯，抑制頭頸癌的功效比化療藥強(qiáng)3倍，與化療藥混合使用，療效更較單獨(dú)使用化療藥高40倍，以蔬果天然含有的蛇麻醇酯來制抗癌藥，不含毒性，副作用將大大減低”。

有關(guān)蛇麻醇酯的簡便分析方法國內(nèi)外研究者很少，試劑公司提供本標(biāo)準(zhǔn)品的分析方法為薄層色譜法，這種分析方法對于定量分析的準(zhǔn)確度和精確度均不高。有研究采用HPLC法分析蛇麻醇酯，與其他三萜系化合物同時(shí)分離，其分離時(shí)間長達(dá)70min以上[9]，不經(jīng)濟(jì)也不快捷。本研究在Martelanc等[10]對蛇麻醇酯較簡便快速分析的基礎(chǔ)上，改用甲醇為主要流動(dòng)相，可使蛇麻醇酯標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的蛇麻醇酯得到快速分離，分離時(shí)間為12.808min，同時(shí)也較為經(jīng)濟(jì)。本實(shí)驗(yàn)分析的青果(橄欖)中含有高含量的蛇麻醇酯，經(jīng)液相/質(zhì)譜(LC/MS)驗(yàn)證，結(jié)果一致的[11]。因此，本研究建立的蛇麻醇酯RP-HPLC快速分離方法，能滿足樣品分析的需要。

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Determination of Lupeol in Fruits by RP-HPLC

XIAO Wei-qiang1，HUANG Gui-ying2，DAI Hong-fen1，CHEN Yue-jiao2，HUANG Bing-xiong1，MA Ying-dan2，WANG Xiao-rong1,*
(1. Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China；
2. Zhongkai University of Agriculture and Engineering , Guangzhou 510225, China)

A simple method was developed for determining lupeol in fruits by reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Separation was carried out on reversed-phase Nucleosil C18 column (5μm, 250 mm × 4.6 mm i.d.) by using a mixture of methanol and water (20:80, pH 3.2 ± 0.05 adjusted by 50% phosphoric acid) as mobile phase A, and methanol containing 0.01% phosphoric acid as mobile phase B (A:B = 4:96) at a flow rate of 1.2 mL/min. The column temperature was hold at 40 ℃, and the detection wavelength was set as 210 nm. The correlation coefficient of the linear calibration curve (y = 4.6068x + 11.2640) was 0.9992 at the concentration range of 5 to 250μg/mL. The relative standard deviations(RSDs) of retention time and peak area in precision experiments for 5 replicate analyses and 9 replicate analyses in 48 h were 0.2107% and 1.2843%, and 0.3383% and 1.9737%, respectively. The recovery rate range was between 94.971% and 101.964%with a RSD of 2.5825%. The detection limit of this method was 1.8886μg/mL. The content of lupeol in dried Chinese olive powder was 359 μg/g, which was higher than that in strawberry, banana, Jufeng grape, American red grape and papaya. Therefore, the developed method is practicable for qualitative and quantitative determination of lupeol in fruits.

reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)；lupeol；fruit

TS207.3

A

1002-6630(2011)10-0183-03

2010-08-30

廣東省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2006B20201045)

肖維強(qiáng)(1968—)，男，高級農(nóng)藝師，碩士，研究方向?yàn)楣芳庸ぜ八斜＝〕煞值姆治?。E-mail：xwq6817@126.com

*通信作者：王曉容(1954—)，女，研究員，本科，研究方向?yàn)閮x器分析。E-mail：wang999983@126.com