韓 帥，李淑燕，陳芹芹，李 珊，倪元穎*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化閃式提取胡柚皮中黃酮類化合物工藝

韓 帥，李淑燕，陳芹芹，李 珊，倪元穎*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

以胡柚皮為原料，采用閃式提取技術(shù)提取胡柚皮中黃酮類化合物。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對提取溶劑濃度、料液比、提取時間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時間、液料比對黃酮提取率的影響比較顯著，最佳工藝條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)78%、液料比31:1(mL/g)、提取時間95s，由此得到的柚皮黃酮提取率為4.37%。閃式提取法是一種快速有效的柚皮黃酮的提取方法。

胡柚皮；閃式提?。稽S酮；響應(yīng)面

常山胡柚(Citrus Chang shan-huyou Y.B. Chang)是常山特有的柑橘地方品種，為蕓香科植物柚[Citrus grandis(L.) Osbeck]與甜橙[Citrus sinensis (L.) Osbeck]的雜交品種，已有近百年的栽培歷史[1]。2009年僅浙江常山縣胡柚種植面積就達(dá)到了10.5萬畝，產(chǎn)量達(dá)到了13.6萬噸。胡柚富含多種營養(yǎng)活性物質(zhì)，且風(fēng)味獨特，胡柚皮約占整個果重的30%，其中富含了豐富的香精油，果膠，黃酮類化合物和色素等成分，是一種寶貴的食物資源[2-3]。黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的一類天然產(chǎn)物，其在抗氧化[4]、預(yù)防心血管疾病[5]、抗菌[6]、抗腫瘤[7]等方面展現(xiàn)了良好的生物活性，被廣泛應(yīng)用于制藥和食品行業(yè)。胡柚皮作為下腳料常常得不到利用被丟棄，造成了資源的浪費，提取其中富含的黃酮類物質(zhì)是對柚果皮綜合利用的有效途徑之一，具有潛在的開發(fā)利用價值和可觀的經(jīng)濟效益。

閃式提取技術(shù)是一種新興的天然產(chǎn)物提取技術(shù)，其依靠機械剪切力和超速動態(tài)分子滲透作用，在室溫及溶劑存在下數(shù)秒內(nèi)將植物組織破碎至細(xì)微顆粒，并使有效成分達(dá)到組織內(nèi)外平衡，實現(xiàn)提取目的[8]。閃式提取技術(shù)能最大限度的避免植物有效成分受熱破壞、具有溶劑用量小、提取時間短、效率高、處理量大、安全可靠等特點[9]。

本研究采用閃式提取法提取胡柚皮中的總黃酮，結(jié)合中心旋轉(zhuǎn)回歸試驗(central composite design，CCD)和響應(yīng)曲面(RSM)分析方法對影響胡柚皮總黃酮提取率的主要因素進(jìn)行分析，從而確定閃式提取的適宜工藝，為規(guī)?；崛¤制S酮、開發(fā)新產(chǎn)品以及綜合利用胡柚皮提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的常山胡柚購于北京。將胡柚果皮剝下后用清水洗凈，在室內(nèi)晾至24h后切成約0.2cm×0.2cm×0.2cm的小塊，放入熱風(fēng)干燥箱40℃烘干12h，用破碎機粉碎至粉末，過40目篩后備用。

NaNO2、AL(NO)3、NaOH、乙醇、正己烷等(均為分析純) 北京藍(lán)弋化工公司；蘆丁對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥91.7%) 中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設(shè)備

BP221S精密電子天平 德國Satorious公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；UV757CRT紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Hitachi Himac CR22g高速冷凍離心機 日本日立株式會社；JHBE-50S閃失提取器 河南金鼐科技發(fā)展有限公司；WKX高速粉碎機 青州市精誠機械有限公司；S22-2恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參照文獻(xiàn)[10]方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取減壓干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25mg，用無水乙醇溶解定容于25mL容量瓶中，搖勻，得到1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于25mL容量瓶中，分別加入0.8mL 5% NaNO2溶液1mL，搖勻，靜置6min，再加入0.8mL 10% Al(NO3)3搖勻，放置6min，然后再加入10mL 1moL/L NaOH溶液，搖勻顯色，以蒸餾水定容至刻度，靜置15min。以零管為空白，光程1cm，在波長510nm處測定各容量瓶溶液的吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，得到回歸方程C=6.1225A－0.0263，R2=0.9998。

1.3.2 樣品中黃酮含量的測定

準(zhǔn)確稱取柚皮粉10.0g，放入三角瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液室溫下浸泡，磁力攪拌5min，采用閃式提取器在120V電壓(r=3500r/min)條件下，提取一定時間，提取完成后，轉(zhuǎn)移至離心機中，在轉(zhuǎn)速4000r/min條件下離心20min，收集上層清液，將濾渣重復(fù)上述過程提取若干次。合并收集的清液，減壓濃縮(t≤50℃)后采用30mL正己烷脫色兩次，用提取體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容至100mL。取提取液1mL加入25mL容量瓶中，按

1.3.1節(jié)所述方法測定其在波長510nm處的吸光度，然后按照下式計算胡柚皮中黃酮類化合物的提取率。

式中：n為提取溶液的稀釋倍數(shù)；C為柚皮提取液的黃酮質(zhì)量濃度/(g/mL)；V為提取液的體積/mL；m為原料的質(zhì)量/g。

1.3.3 閃式提取工藝試驗設(shè)計

1.3.3.1 提取溶劑的選擇

準(zhǔn)確稱取柚皮粉末4份，每份10.0g，分別采用無水甲醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯各150mL溶解，經(jīng)閃式提取60s后，按1.3.2節(jié)所述方法完成吸光度的測定，計算不同溶劑時的柚皮黃酮提取率。

1.3.3.2 試驗設(shè)計

首先進(jìn)行單因素試驗，選取溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以柚皮黃酮提取率為指標(biāo)。各因素水平見表1。

表1 單因素試驗因素水平Table 1 Factors and levels in single-factor design

1.3.3.3 CCD優(yōu)化試驗設(shè)計

表2 響應(yīng)面三因素五水平試驗設(shè)計Table 2 Factors and levels in response surface analysis

采用Design Expert軟件，采用CCD[11]建立數(shù)學(xué)模型，以溶劑體積分?jǐn)?shù)X1、液料比X2和提取時間X3三個因素為自變量，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX對自變量進(jìn)行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長。以柚皮黃酮提取率為響應(yīng)值，建立回歸方程模型。由此求出影響因素的一次效應(yīng)，二次效應(yīng)及交互效應(yīng)，實現(xiàn)對柚皮黃酮提取工藝優(yōu)化，并做響應(yīng)面法分析。中心復(fù)合試驗各因素和水平見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

圖1 不同提取溶劑對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of solvent type on extraction efficiency of flavonoids

由圖1可知，采用無水甲醇和無水乙醇作為提取溶劑，提取效果更加理想，而丙酮和乙酸乙酯做溶劑，黃酮提取率相對較低。從提取率上來看，甲醇提取率較乙醇略高，但經(jīng)多重比較看，甲醇和乙醇的提取率并不存在顯著性差異，但考慮到甲醇的毒性以及易對環(huán)境造成的污染，從使用安全和環(huán)保的角度考慮，選擇乙醇作為提取胡柚皮黃酮的提取試劑。

2.2 溶劑體積分?jǐn)?shù)對柚皮黃酮提取率的影響

圖2 溶劑體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of flavonoids

在液料比20:1(mL/g)、提取時間60s、提取1次的條件下，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對胡柚皮黃酮提取率的影響如圖2所示。結(jié)果表明，隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)增加，黃酮提取率也隨之增大，當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時，柚皮黃酮的提取率最高，達(dá)到了3.82%。之后隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)增高提取率逐漸下降。經(jīng)多重比較可知，各點之間的黃酮提取率差異顯著。提取液中乙醇含量越高，溶劑極性越低，黃酮為弱極性分子，根據(jù)相似相溶原理，溶液極性與黃酮極性相近從而有利于黃酮的析出，黃酮提取率達(dá)到最高[12]，低于80%時柚皮中的黃酮化合物并未完全浸出，體積分?jǐn)?shù)高于80%時，滲透壓增大，一些脂溶性物質(zhì)的溶解度增加，影響了黃酮類物質(zhì)的溶解。最終選定乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.3 液料比對柚皮黃酮提取率的影響

圖3 液料比對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid/material ratio on extraction efficiency of flavonoids

在乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)80%、提取時間60s、提取1次的條件下，料液比對柚皮黃酮提取率的影響如圖3所示。結(jié)果表明隨著液料比的增大，柚皮黃酮的提取率也逐漸增大，在液料比在15:1～30:1時，黃酮的提取率增大的較快，當(dāng)液料比大于30:1時，增長延緩，并呈現(xiàn)出下降趨勢。這是由于一定量的柚皮粉，溶劑用量的增加可以增加柚皮粉與提取溶劑的接觸面積，增大固液濃度差，有利于擴散速度的提高[13]。當(dāng)液料比達(dá)到一定程度時，繼續(xù)增大液料比，固液濃度差增幅不太明顯，從而提取率增勢趨于和緩，過多的提取溶劑反而會使提取率降低，并且不利于試劑的節(jié)約，增加后續(xù)的濃縮過程的工作量，因此選定提取的液料比為30:1。

2.4 提取時間對柚皮黃酮提取率的影響

圖4 提取時間對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency of flavonoids

在乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)80%、液料比30:1、提取1次的條件下，提取時間對柚皮黃酮提取率的影響如圖4所示。結(jié)果表明，由于黃酮析出是一個動態(tài)的過程，從提取開始到提取90s，提取率顯著增加，然后出現(xiàn)提取率隨時間延長反而緩慢降低的趨勢。這可能是因為閃提過程中由于刀頭剪切力的作用產(chǎn)生了大量的熱，隨著提取時間的延長，溶液溫度升高很快。當(dāng)達(dá)到一定溫度時，黃酮類化合物易發(fā)生氧化作用，進(jìn)而導(dǎo)致柚皮中黃酮化合物結(jié)構(gòu)遭到破壞而使黃酮提取率降低。為防止柚皮黃酮化合物長時間受熱發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，影響產(chǎn)品的純度和質(zhì)量，并提高提取效率，可選擇90s作為提取黃酮的最佳時間。

2.5 提取次數(shù)對柚皮黃酮提取率的影響

圖5 提取次數(shù)對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of number of repeated extraction on extraction efficiency of flavonoids

在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比30:1、提取時間90s的條件下，提取次數(shù)對柚皮黃酮提取率的影響如圖5所示。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的的提高，柚皮提取液中殘留的黃酮含量逐漸降低，經(jīng)過兩次提取后，繼續(xù)提高次數(shù)，黃酮提取率增加不明顯，這說明提取兩次已經(jīng)提取的比較完全，從節(jié)約試劑和減小后續(xù)濃縮環(huán)節(jié)工作的角度考慮，閃式提取的提取次數(shù)確定為兩次。

2.6 黃酮類化合物提取工藝回歸模型的建立及方差分析

表3 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface analysis

表3給出了響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取柚皮黃酮工藝的結(jié)果，采用Design Expert軟件，選定CCD模型，對試驗設(shè)計中各組的黃酮提取率進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：

式中：Y為柚皮黃酮提取率；x1、x2、x3分別為溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間3個自變量的編碼值。

模型的方差分析結(jié)果見表4。模型的F值為76.39(P＜0.0001)，說明所選模型極為顯著。失擬項P=0.0944＞0.05，失擬項差異不顯著，方程對實驗擬合程度較好。模型相關(guān)系數(shù)是0.9885，矯正決定系數(shù)為0.9756，說明該模型能解釋98.85%的響應(yīng)值變化，僅有1.15%的變異不能用此模型解釋；而相關(guān)系數(shù)與校正系數(shù)接近，說明該模型的擬合度和可行度高，實驗誤差小，可以用于對閃式提取胡柚皮中黃酮化合物的工藝結(jié)果的分析和預(yù)測，能夠充分描述各實驗因素對實驗指標(biāo)的影響規(guī)律。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

對模型進(jìn)行模型系數(shù)的顯著性檢驗，結(jié)果見表5。經(jīng)Statistic 6.0軟件處理后，可見二次多元回歸方程的常數(shù)項極顯著，一次項x1、x2、x3，二次項x22、x12、x32極顯著(P＜0.0001)，交互項x2x3顯著(P＜0.05)，其余不顯著。依據(jù)方程中一次項t值的絕對值大小可知，因素主效應(yīng)關(guān)系為液料比＞溶劑體積分?jǐn)?shù)＞提取時間。

表5 回歸方程模型系數(shù)的顯著性檢驗Table 5 Significance of each coefficient in the fitted regression model

2.7 響應(yīng)面分析

根據(jù)CCD模型建立的二次回歸方程，固定一個因素在編碼值0的水平，分析另外兩因素對柚皮黃酮提取率的影響，利用Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，探討各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響。

結(jié)果表明，液料比固定在30:1時，在設(shè)定的提取時間范圍內(nèi)，隨著溶劑體積分?jǐn)?shù)的增高，黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢；而當(dāng)溶劑體積分?jǐn)?shù)在72%～82%范圍內(nèi)時，隨著提取時間的延長，黃酮提取率呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，從變化速率來看，溶劑體積分?jǐn)?shù)的主效應(yīng)要大于提取時間，與統(tǒng)計學(xué)分析一致；當(dāng)提取時間設(shè)定為90s時，料液比在27:1～32:1之間時，隨著溶劑體積分?jǐn)?shù)的增高，黃酮提取率先升高后降低，變化速率表明，料液比的主效應(yīng)要大于溶劑體積分?jǐn)?shù)，與統(tǒng)計分析相符。因此可知，在試驗水平范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)脑黾犹崛∫毫媳扔欣邳S酮提取率的增大，并可以節(jié)省提取時間。在各因素中，液料比和提取時間之間的交互作用最為顯著。

2.8 工藝優(yōu)化與驗證實驗

采用Design Expert軟件完成優(yōu)化，得到的優(yōu)化結(jié)果為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)78.37%、液料比31.15:1(mL/g)、提取時間94.50s，在此條件下胡柚皮黃酮的提取率達(dá)4.32%。

將提取工藝參數(shù)修正為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)78%、液料比31:1(mL/g)、提取時間95s，進(jìn)行驗證實驗，最終測得3次平行實驗的黃酮提取率平均為4.37%，略高于Design Expert軟件的預(yù)測值，由此可以認(rèn)為實驗?zāi)Ｐ瓦x擇合理，結(jié)果理想。

3 結(jié) 論

利用Design Expert軟件，采用CCD模型，建立了柚皮黃酮提取率的二次多元線性回歸方程：

優(yōu)化出胡柚皮黃酮提取率的條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)78%、液料比31:1(mL/g)、提取時間95s，最終所得到的柚皮黃酮提取率為4.37%。

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Response Surface Methodology as an Approach to Optimization of Flash-extraction of Flavonoids from Peel of Citrus Changshan-huyou

HAN Shuai，LI Shu-yan，CHEN Qin-qin，LI Shan，NI Yuan-ying*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The peels of citrus Changshan-huyou were used as the raw material to extract flavonoids by flash-extraction technology. Based on single factor experiments, extraction conditions such as solvent concentration, liquid/material ratio, and extraction time were optimized by response surface methodology. The results showed that each of the three extraction conditions affected flavonoid extraction significantly. The optimized conditions were as follows: 78% ethanol concentration, 31:1 liquid/material ratio, and 95 s extraction time, resulting in an extraction efficiency of 4.37% for flavonoids. As a conclusion, flashextraction is an effective and efficient method to extract flavonoids from peel of Citrus Changshan-huyou.

citrus Changshan-huyou peel；flash-extraction；flavonoids；response surface methodology

TS255.1

A

1002-6630(2011)10-0052-05

2010-07-23

韓帥(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品天然產(chǎn)物的提取與功能性質(zhì)。E-mail：topaik@163.com

*通信作者：倪元穎(1960—)，女，教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物的提取與功能性食品開發(fā)。E-mail：niyuanying@163.com