王新偉，趙 瀅，沈育杰*

(中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 吉林 132109)

山葡萄籽中原花青素提取工藝優(yōu)化

王新偉，趙 瀅，沈育杰*

(中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 吉林 132109)

目的：通過單因素與正交試驗研究不同的提取溫度、料液比、時間、溶劑體積分數(shù)等因素對原花青素提取率的影響，確定最佳提取工藝參數(shù)。方法：以山葡萄籽為原料，乙醇作為提取劑，通過香草醛-HPLC法測定提取物中原花青素的提取率，香草醛法測定黃烷—3—醇單體與原花青素的總含量，HPLC法測定黃烷—3—醇單體的含量，二者之差為原花青素總含量。結果：最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)70%、提取時間120min、提取溫度60℃、料液比1:5(g/mL)。結論：在此工藝參數(shù)下，原花青素提取率為3.12%。

山葡萄籽；原花青素；提??；香草醛；高效液相色譜法(HPLC)

原花青素為植物中一大類酚類物質的統(tǒng)稱[1]，廣泛存在于各種植物中，因在熱酸性條件下能轉化成花青素而得名[2]，它是由兒茶素或表兒茶素單體以C4-C6或C4-C8連接而成，結構中富含活潑羥基[3]，具有很強的抗氧化能力[4]，目前原花青素已廣泛應用于食品[5]、藥品[6]、化妝品[7]和保健品[8]等行業(yè)和領域。

山葡萄(Vitis amurensis Rupr)，又名東北山葡萄，主產于中國東北，俄羅斯遠東和朝鮮等地區(qū)[9]山葡萄籽是目前已知原花青素最為豐富的資源[10]，其所含的黃酮類物質是歐亞種葡萄的4倍左右[11]。

吉林省是我國山葡萄酒的主產區(qū)，年產量在20萬噸左右，山葡萄籽作為釀酒副產物主要被當做廢棄物，既造成資源浪費又帶來環(huán)境污染。本實驗對從山葡萄籽中提取原花青素的工藝進行研究，具有很大的經濟和生態(tài)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山葡萄籽 中國農業(yè)科學院特產研究所；原花青素標品、兒茶素標品、表兒茶素標品、沒食子酸標品、表兒茶素沒食子酸酯標品 天津尖峰天然產物研究開發(fā)有限公司；香草醛(分析純) 天津光復精細化工研究所；乙醇(分析純)、甲醇(分析純)、乙酸(分析純) 北京化工廠；鹽酸(分析純) 煙臺雙雙化工有限公司；乙腈(色譜純) 美國Honey Well公司。

1.2 儀器與設備

FW80型粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；IOTAVATO12-124型旋轉蒸發(fā)儀 德國Buchi公司；HWS-24型恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；HZF-211型真空干燥箱 上海弘越實驗設備有限公司；UV-2450型紫外分光光度計 日本島津公司；1200型高效液相色譜儀器(DAD檢測器) 美國安捷倫公司。

1.3 原花青素制備與檢測

1.3.1 原花青素制備

山葡萄籽粉脫脂，將干燥山葡萄籽粉碎后，按料液比1:3(g/mL)加入石油醚密封，間歇振蕩，48h后抽濾，通風脫去殘留石油醚。脫脂山葡萄籽粉置于三角瓶中密封，按照一定料液比加入提取劑，水浴加熱，間歇振蕩一定時間后，抽濾除去殘渣，濾液用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸濃縮后置于真空干燥箱中干燥得到原花青素粗品。

1.3.2 原花青素的含量測定方法

采用香草醛-濃鹽酸法檢測原花青素與黃烷－3－醇單體的總含量，HPLC法測定黃烷－3－醇單體的含量，在實際操作中以沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯4種單體來代表黃烷－3－類單體[12]的總含量，二者之差為原花青素含量。

式中：C為吸光度在標準曲線上對應的樣品的質量濃度；n為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；W為樣品定容以后的體積；Tp為脫脂葡萄籽粉末中原花青素的含量。

1.3.2.1 香草醛-濃鹽酸法

顯色劑配制：精確稱量1.00g香草醛，8mL濃鹽酸用甲醇定容于200mL容量瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。將原花青素標準品配制成0.00、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40mg/mL的甲醇溶液，取1mL標品溶液與5mL顯色劑立即混勻，在30℃避光反應30min，以甲醇做空白對照，于波長500nm處測量吸光度，建立標準曲線：y=1.8839x－0.0223，R2=0.99792。

將原花青素粗品用甲醇稀釋1000倍后按上述方法測定原花青素與單體的總含量。

1.3.2.2 HPLC法測定單體含量

色譜條件：色譜柱Angilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；保護柱：Angilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×12.5mm，5μm)。DAD檢測器，波長280nm，流速0.8mL/min，柱溫30℃。流動相A：1%乙酸；流動相B：乙腈-水-乙酸(80:19:1)。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 HPLC elution program

標準曲線制備：分別將沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯標品溶解于甲醇中，配制成質量濃度分別為0.50、0.40、0.30、0.20、0.10mg/mL的溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后依次進樣，標準曲線如表2所示。

表2 4種單體標準曲線Table 2 Standard curves of 4 mono-phenols

將原花青素粗品甲醇稀釋溶液用0.45μ m微孔濾膜過濾后進樣，測定4種單體總的含量。

1.4 單因素試驗

1.4.1 粉碎度的影響

山葡萄籽分別粉碎成10、20、30、40、50目后脫脂，精確稱量5份質量為5.00g的山葡萄籽粉末，1:7的料液比分別加入到60%的乙醇溶液，50℃提取80min，測定提取率。

1.4.2 提取溫度的影響

精確稱量5份質量為5.00g的脫脂山葡萄籽粉，1:7的料液比加入60%的乙醇溶液中，分別置于溫度為40、50、60、70、80℃，的水浴中提取80min，測定提取率。

1.4.3 提取劑體積分數(shù)對提取率的影響

精確稱量5份質量為5.00g的脫脂山葡萄籽粉末，1:7的料液比分別加入到體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液中，50℃水浴加熱80min測定提取率。

1.4.4 料液比對提取率的影響

精確稱量5份質量為5.00g的山葡萄籽粉分別加入到料液比為1:4、1:5、1:6、1:7、1:8的60%乙醇溶液，于50℃中反應80min測定提取率。

1.4.5 提取時間對提取率的影響

分別稱取5份質量為5.00g脫脂山葡萄籽粉，1:7的料液比加入60%的乙醇溶液，50℃水浴中反應60、80、100、120、140min后測定提取率。

1.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取對原花青素提取率影響最大的4個因素——提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)和料液比，利用正交試驗設計確定最優(yōu)化的提取方案，試驗結果用SAS軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗對山葡萄籽中原花青素提取率的影響

2.1.1 粉碎度對提取率的影響

圖1 粉碎度對提取率的影響Fig.1 Effect of particle size of crushed Amur grape seeds on extraction rate of proanthicyanidins

由圖1可知，山葡萄籽的粉碎度在20目時提取率最高，隨著粉碎度的進一步增大，提取率呈下降的趨勢，這是因為在粉碎過程中產生大量的熱將部分原花青素氧化分解，另一方面粉碎度越高山葡萄籽中所含多糖，蛋白質等雜質成分析出也越多[13]，造成提取物的純度下降的同時還會導致溶液黏稠度上升，給后續(xù)的抽濾帶來很大困難，加大了后續(xù)工作的難度，綜上所述，山葡萄籽最適宜粉碎度為20目。

2.1.2 提取溫度對提取率的影響

圖2 提取溫度對提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of proanthicyanidins

由圖2可知，隨著溫度的上升，提取率也隨之增大，在60℃達到最大值且趨于平衡，隨著溫度進一步升高，提取率呈下降趨勢，這因為原花青素在高溫易被氧化，溫度越高原花青素的結構越容易被破壞，活性成分損失很大，還會造成雜質析出過多影響產品純度[14]，因此提取溫度不宜超過70℃。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，原花青素的提取率也逐漸升高，在乙醇體積分數(shù)為60%時達到最大值，隨后隨著乙醇體積分數(shù)的增大提取率呈下降趨勢，這是因為水在溶劑中起到穿透細胞壁的作用，在提取過程中有利于原花青素的析出，若溶劑中含水量過低時溶劑對細胞壁的穿透作用下降導致提取率下降，因此最佳體積分數(shù)為60%。

圖3 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate of proanthicyanidins

2.1.4 料液比對提取率的影響

圖4 料液比對提取率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of proanthicyanidins

由圖4可知，隨著料液比的減小原花青素提取率逐漸增加，在料液比為1:6時達到最大值，隨后提取率呈穩(wěn)定的趨勢，說明此時原花青素已經接近析出完全，繼續(xù)減小料液比會造成后續(xù)步驟加壓蒸餾時間的延長和溶劑的浪費，因此最佳料液比為1:6。

2.1.5 提取時間對提取率的影響

圖5 提取時間對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of proanthicyanidins

由圖5可知，提取率隨時間的延長逐漸增加，在100min時原花青素浸出率達到最大值，以后趨于穩(wěn)定并逐漸下降，原因是隨著反應時間的延長，原花青素被空氣中的氧氣氧化從而導致結構發(fā)生改變。

2.2 正交試驗結果

經過分析極差(表3、4)得知，各因素對原花青素提取率大小的影響分別為C＞B＞A＞D，最佳提取方案為溫度60℃、乙醇體積分數(shù)70%、時間為120min、料液比為1:5。

表3 山葡萄籽中提取原花青素提取工藝正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels in orthogonal tests for optimizing the extraction process of proanthicyanidins

表4 山葡萄籽中提取原花青素提取工藝正交試驗設計及結果Table 4 Results of orthogonal tests for optimizing the extraction process of proanthicyanidins

通過方差分析(表5)可知，4個因素的差異性非常顯著，證明結果可靠，確定最佳提取工藝為溫度60℃、體積分數(shù)70%、時間120min、料液比1:5。

表5 正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis

圖6 樣品色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of proanthicyanidins extract from Amur grape seeds

精確稱取3份質量為5.00g的脫脂山葡萄籽粉末，按照上述優(yōu)化條件進行提取，原花青素提取率為3.12%，4種單體的總含量為0.52%，樣品色譜圖如圖6所示。

其中沒食子酸與表兒茶素沒食子酸酯的含量為4種單體總含量的3.8%，葡萄籽提取物中，沒食子酸與表兒茶素沒食子酸酯的含量為4%～5%[15]。

3 結 論

對山葡萄種子提取物中黃烷－3－醇單體的色譜洗脫程序進行了優(yōu)化選擇，摸索出的流動相條件可以在短時間內實現(xiàn)單體物質的完全分離，為從山葡萄籽中進一步分離其他單體活性成分提供了基礎。

通過正交試驗確定山葡萄籽中原花青素的最佳提取工藝為提取溫度60℃、乙醇體積分數(shù)70%、料液比1:5(g/mL)、提取時間120min，原花青素提取率為3.12%，單體提取率為0.52%。

葡萄籽中提取純化原花青素的工藝技術已經成熟，山葡萄籽的開發(fā)和利用目前處于起步階段，下一步的研究的方向應集中于對山葡萄籽提取物種的原花青素成分進行進一步的純化研究以提高產品的純度。

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Optimization of Extraction Process for Proanthicyanidins from Amur Grape Seeds

WANG Xin-wei，ZHAO Ying，SHEN Yu-jie*
(Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Jinlin 132109, China)

Objective: To investigate the effects of temperature, time and ethanol concentration and material/liquid ratio on proanthicyanidins extraction from Amur grape seeds through single-factor and orthogonal tests and to explore the optimal extraction process. Methods: Ethanol was used for the extraction of proanthicyanidins. The total content of flavan-3-ol monomers and proanthicyanidins (both of them can be simultaneously extracted by ethanol) was determined by vanillin method,and the method used to determine the content of flavan-3-ol monomers was HPLC. Thus, the content of proanthicyanidins could be calculated as the difference between the two determined values. Results: The optimal extraction process conditions were extraction temperature of 60 ℃, ethanol concentration of 70%, extraction time of 120 min and material/liquid ratio of 1:5 (g/mL).Conclusion: Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of proanthicyanidins from Amur grape seeds was up to 3.12%.

Amur grape seeds；proanthocyanidins；extraction；vanillin；HPLC

S663.1

A

1002-6630(2011)10-0021-04

2010-08-13

農業(yè)部作物種質資源保護項目(NB2010-2130135-36)；國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(nycytx-30-01)

王新偉(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為經濟植物種質資源評價與利用。E-mail：nhkswxw@126.com

*通信作者：沈育杰(1951—)，男，研究員，本科，研究方向為抗寒葡萄育種和種質資源收集保護。E-mail：tcssyj@126.com