郭嬌嬌，方 敏，林利美，宮智勇,*

(1.武漢工業(yè)學院食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，湖北 武漢 430030)

蘋果多酚的提取及抗氧化活性研究

郭嬌嬌1，方 敏2，林利美1，宮智勇1,*

(1.武漢工業(yè)學院食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，湖北 武漢 430030)

通過單因素及正交試驗，對蘋果多酚的提取工藝進行研究。確定蘋果多酚的最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)30%、溫度70℃、料液比1:6、提取時間45min，此時蘋果多酚的含量為9.032mg/g。采用DPPH法和亞鐵還原能力(ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP)法對蘋果多酚的抗氧化活性進行研究，結(jié)果顯示，它對DPPH自由基的清除率達到94.6%，此時其FRAP值為546.4μmol/L。

蘋果多酚；抗氧化；DPPH自由基；亞鐵還原能力(FRAP)

蘋果，薔薇科落葉喬木。蘋果中含有豐富的營養(yǎng)成分，位于我國四大水果之首[1]。蘋果成分復雜，含有多酚類、黃酮類、色素類等多種成分[2]，蘋果多酚是從蘋果中提取出來的天然的抗氧化劑，其主要成分為類黃酮類化合物。很多研究表明，蘋果多酚具有重要的生物活性物質(zhì)和多種藥理功能，具有減少和消除自由基、抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化、抗菌、保護軟骨、增強骨質(zhì)、抗腫瘤、防輻射、抗動脈硬化等生理活性[3-6]。因此，開發(fā)和利用蘋果多酚具有一定實用價值。

近來年，關于蘋果中多酚的提取及抗氧化活性的研究較多，但是方法和結(jié)果都不盡相同。為此，本實驗在前人研究的基礎上，通過采用乙醇回流法[7-8]提取蘋果中的生物活性物質(zhì)-多酚，采用Folin-ciocalteu法[9]對多酚的含量進行檢測，探討此方法提取的最優(yōu)條件，為蘋果中活性物質(zhì)的提取提供參考。同時采用DPPH法和亞鐵還原能力(ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP)法初步研究蘋果多酚提取液的抗氧化活性，為進一步開發(fā)利用蘋果提供可靠的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果 市購。

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl))、TPTZ(1,3,5- tri(2-pyridyl)-2,4,6-triazine) 美國Sigma公司；沒食子酸 中國藥品生物制品檢定所；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

7200可見分光光度計、UV型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；Ar2140型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SZ-93自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精密試驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

新鮮紅富士蘋果，實驗前切碎勻漿，現(xiàn)制現(xiàn)用。

1.3.2 沒食子酸標準曲線的繪制

采用Folin-ciocalteu法[9]，利用紫外可見分光光度計在760nm波長處、以1cm比色皿，測定吸光度。以吸光度為縱坐標，質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制沒食子酸標準曲線，其線性回歸方程為：Y＝121.14x＋0.0171，R2＝ 0.9991。

1.3.3 蘋果多酚的提取及含量測定

精確稱取切碎勻漿后的新鮮蘋果8.00g，用40mL 20%乙醇在70℃回流提取45min，過濾，真空濃縮干燥得粗多酚樣品，用雙蒸水定容至50mL，即為所得多酚提取液。然后按照繪制標準曲線的方法操作，測定樣品中的吸光度，帶入回歸方程，計算出蘋果中多酚的含量。

1.3.4 蘋果多酚提取的單因素和正交試驗

利用乙醇回流法，選取提取溫度、提取時間、料液比(g/mL)、乙醇體積分數(shù)為影響因素，進行單因素試驗，然后根據(jù)單因素試驗結(jié)果設計正交試驗，依據(jù)標準曲線的測定方法測定提取液的吸光度，并根據(jù)線性回歸方程計算蘋果多酚提取率，以蘋果多酚提取率為考察指標，確定蘋果多酚提取最佳工藝條件。

1.3.5 蘋果多酚抗氧化活性的測定

1.3.5.1 對DPPH自由基的清除作用[10-12]

DPPH法是利用DPPH溶液的特征紫紅色團的吸收峰，以分光光度法測定加抗氧化劑或植物提取液后吸光度吸收的下降表示其對有機自由基清除能力[13]。本實驗在正交試驗最佳提取工藝條件下提取蘋果多酚，過濾，真空濃縮干燥得粗多酚樣品，用雙蒸水配制成一定濃度的蘋果多酚溶液，依據(jù)參考文獻[7]中的方法測定蘋果多酚對DPPH自由基的清除率。測定時每個樣品進行3次平行實驗。

式中：Ai為2mL DPPH溶液＋2mL蘋果多酚提取液的吸光度；Aj為2mL蘋果多酚提取液＋2mL無水乙醇的吸光度；Ac為2mL DPPH溶液＋2mL無水乙醇的吸光度。

1.3.5.2 FRAP 法測定蘋果多酚的總抗氧化能力[14]

蘋果多酚的總抗氧化能力測定采用FRAP法。Fe3＋吡啶三吖嗪可被樣品中的還原物質(zhì)還原為二價鐵形式，呈現(xiàn)出藍色，于593nm波長處具有最大吸收光，根據(jù)所得吸光度的大小計算樣品抗氧化活性的強弱。TPTZ工作液的配制[15]：將2.5mL 20mmol/L FeCl3·6H2O，2.5mL 10mmol/L TPTZ(以40mmol/L鹽酸溶解)，25mL 0.3mmol/L的醋酸緩沖液(pH3.6)，臨用前混合。

FeSO4標準曲線繪制：分別取不同質(zhì)量濃度的FeSO4溶液各0.3mL，各加入2.7mL預熱至37℃的TPTZ工作液，搖勻后放置10min，于593nm處測其吸光度。以吸光度為縱坐標，F(xiàn)eSO4質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，結(jié)果如圖2，其線性回歸方程為：Y＝0.0041X＋0.0197，R2＝ 0.995。

樣品總抗氧化能力的測定：準確吸取蘋果多酚樣品溶液0.3mL，加入2.7mL 預熱至37℃的TPTZ工作液。搖勻后放置10min，于593nm 波長處測其吸光度(用無水乙醇作為參比)。以無水乙醇代替樣品加入FRAP工作液作為空白，每個稀釋度做3次平行試驗。由反應后A值在標準曲線上獲得的相應的FeSO4濃度(μmol/L)定義為FRAP值。FRAP值越大，抗氧化活性越強[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果多酚提取單因素試驗

2.1.1 提取溫度對蘋果多酚提取效果的影響

準確稱取8g新鮮蘋果勻漿5份，加入20%乙醇40mL，分別在40、50、60、70、80℃下，回流提取45min，過濾，真空濃縮干燥得粗多酚樣品，用雙蒸水定容至50mL，即為所得多酚提取液，然后按照繪制標準曲線的方法操作，測定樣品中的吸光度，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溫度對蘋果多酚提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of apple polyphenols

由圖1可知，隨著溫度的升高，蘋果多酚的提取效果先降低后升高，然后又降低，在提取溫度為70℃，蘋果多酚的提取效果最好。

2.1.2 提取時間對蘋果多酚提取效果的影響

準確稱取8g新鮮蘋果勻漿5份，加入20%乙醇40mL，在70℃分別回流提取30、45、60、75、90min，過濾，真空濃縮干燥得粗多酚樣品，用雙蒸水定容至50mL，即為所得多酚提取液，然后按照繪制標準曲線的方法操作，測定樣品中的吸光度，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對蘋果多酚提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of apple polyphenols

由圖2可知，在提取時間45min時，蘋果多酚的提取效果最好，隨著時間的延長，吸光度有所降低，原因可能是隨著時間的延長，蘋果中其他醇溶性物質(zhì)同時被溶解提取，這些物質(zhì)的存在影響試驗的提取效果。

2.1.3 料液比對蘋果多酚提取效果的影響

準確稱取8g新鮮蘋果勻漿5份，分別加入20%乙醇16、24、32、40、48mL，在70℃回流提取45min，過濾，真空濃縮干燥得粗多酚樣品，用雙蒸水定容至50mL，即為所得多酚提取液，然后按照繪制標準曲線的方法操作，測定樣品中的吸光度，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對蘋果多酚提取效果的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on yield of apple polyphenols

由圖3可知，隨著提取液用量逐漸增加，蘋果多酚的提取效果越來越好，當料液比為1:6(g/mL)時，提取效果最好。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對蘋果多酚提取效果的影響

準確稱取8g新鮮蘋果勻漿5份，分別加入0%、10%、20%、30%、40%乙醇40mL，在70℃回流提取45min，過濾，真空濃縮干燥得粗多酚樣品，用雙蒸水定容至50mL，即為所得多酚提取液，然后按照繪制標準曲線的方法操作，測定樣品中的吸光度，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇體積分數(shù)對蘋果多酚提取效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on yield of apple polyphenols

由圖4可知，隨乙醇體積分數(shù)的升高，提取率先增后減，蘋果多酚最佳提取效果對應的乙醇體積分數(shù)20%。原因可能是提取溶劑中乙醇含量不同，極性也不同。

2.2 蘋果多酚提取的正交試驗結(jié)果

以提取溫度、提取時間、料液比、乙醇體積分數(shù)4因素進行正交試驗設計，確定蘋果多酚提取的最佳條件，試驗因素水平見表1，根據(jù)表1進行正交設計，選用正交表L9(43)，正交試驗結(jié)果和方差分析見表2和表3。

表1 蘋果多酚提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

由表2可知，各影響因素的影響次序為乙醇體積分數(shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時間，其中乙醇體積分數(shù)為最主要的影響因素，最佳組合為A3C1B1D1，即用30%乙醇、料液比1:6、溫度70℃的條件提取45min最合適，此時，蘋果多酚的含量為9.032mg/g。由于提取時間(D)對提取率影響最小，故其在方差分析表中作為誤差項。

由表3可知，F(xiàn)A＞F0.05(2,2)，F(xiàn)B＜F0.05(2,2)，F(xiàn)C＜F0.05(2,2)，所以乙醇體積分數(shù)(A)對提取率影響顯著，料液比(B)和提取溫度(C)對提取率影響不顯著。

表2 蘋果多酚提取L9(43)正交試驗設計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design L9(43) and corresponding experimental results

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of yield of apple polyphenols with various extraction conditions

2.3 蘋果多酚對DPPH自由基的清除作用

設計稀釋倍數(shù)為0、1、10、20倍，清除率見圖5。

圖5 不同濃度的蘋果多酚對DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH free radicals scavenging rates of apple polyphenols at different concentrations

由圖5可知，蘋果多酚提取液對DPPH自由基的清除率隨著稀釋倍數(shù)的增加，清除率逐漸下降。

2.4 FRAP法測定蘋果多酚的總抗氧化能力設計稀釋倍數(shù)為0、1、10、20倍，F(xiàn)RAP值見圖6。由圖6可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，F(xiàn)RAP值逐漸降低，但都比空白對照組的值要高。

圖6 不同濃度蘋果多酚的FRAP值Fig.6 FRAP values of apple polyphenols at different concentrations

3 結(jié) 論

本實驗對蘋果多酚的提取工藝進行探討，得出蘋果中多酚的最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)30%、提取溫度70℃、料液比1:6、提取時間45min，此時蘋果多酚的含量為9.032mg/g，其中乙醇體積分數(shù)對多酚提取的影響顯著，提取溫度和料液比對其影響不顯著。然后對在最優(yōu)條件下提取得到的蘋果多酚提取液進行抗氧化實驗，得出其對DPPH自由基的清除率為94.6%，并且隨著稀釋倍數(shù)的增加，清除率逐漸降低，其總抗氧化能力FRAP值為546.4μmol/L，隨稀釋倍數(shù)的增加，F(xiàn)RAP值也逐漸降低，均表現(xiàn)出良好的抗氧化作用。

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Extraction and Antioxidant Properties of Polyphenols from Apple

GUO Jiao-jiao1，F(xiàn)ANG Min2，LIN Li-mei1，GONG Zhi-yong1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

One-factor-at-a-time coupled with orthogonal array design method was employed to optimize the extraction of polypehnols from apple. The optimal extraction conditions were determined as follows: 30% ethanol as the extraction solvent at a material/liquid ratio of 1:6, 70 ℃ temperature and 45 min extraction time. Under these conditions, the extraction yield of polyphenols from apple was 9.032 mg/g. The DPPH radical scavenging rate of apple polyphenols extracted was 94.6% and the FRAP 546.4 μmol/L.

apple polyphenols；antioxidant properties；DPPH free radicals；FRAP assay

R284.2

A

1002-6630(2011)20-0095-04

2011-06-28

國家“863”計劃項目(2010AA023003)

郭嬌嬌(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：guojiaojiao3344@126.com

*通信作者：宮智勇(1966—)，男，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與毒理。E-mail：gongzycn@yahoo.com