楊學山，楊孝樸，付文力

(甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070)

糖類對羊血超氧化物歧化酶活性的影響

楊學山，楊孝樸，付文力

(甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070)

目的：研究糖類對羊血超氧化物歧化酶(SOD)活性影響關(guān)系。方法：以離子交換層析法制備的羊血SOD為原料，加入不同濃度的麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖和D-甘露糖，25℃分別保溫4、24、48、72h和96h后，利用鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活力，并計算相對酶活力。結(jié)果：海藻糖對羊血SOD有明顯的激活和保護作用，高濃度的麥芽糖和低濃度的乳糖有一定穩(wěn)定作用，其余糖類對SOD活性影響不大。結(jié)論：不同糖類在不同濃度下對羊血SOD活性影響不同。

超氧化物歧化酶；糖類；酶活力

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD EC1, 15,1,1)是一種含有金屬離子的蛋白酶，廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)，催化超氧陰離子(superoxideanions，)轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，對維持機體動態(tài)平衡起重要作用[1]。SOD能防御氧毒性、增強機體抗輻射能力、預防衰老，在一些疾病如腫瘤、炎癥及自身免疫疾病等的治療中有良好的療效[2]。SOD已應用于化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，其開發(fā)與應用前景不可估量。

目前我國主要以牛血和豬血液為原料分離提取SOD，但對羊血SOD研究較少。同時天然SOD具有半衰期短、在水溶液中易失活等缺點，導致保存條件要求高，在一定程度上限制了其應用[3]。因此研究不同濃度糖類在不同時間內(nèi)對羊血SOD活性影響關(guān)系，探討其作用規(guī)律，有助于選擇合適的穩(wěn)定劑，使其在不同產(chǎn)品應用中能更合理的與原輔料配伍，提高和保證產(chǎn)品的有效性，為羊血SOD產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊血采自蘭州小西湖屠宰場。

牛血清白蛋白 上海試劑廠；DEAE-Sephadex A-50 Pharmacia公司；檸檬酸鈉、KH2PO4、K2HPO4、鄰苯三酚等均為分析純；麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、木糖、果糖和海藻糖等均為食品級。

1.2 儀器與設(shè)備

SL-1001電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；TGL-166臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PHS-828 pH計 成都全速科技有限公司；808型紫外-可見分光光度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 羊血SOD分離純化

1.3.1.1 工藝流程

新鮮羊血→預處理→收集紅血球→細胞破碎→熱變性→層析→透析→濃縮→活性測定→成品

1.3.1.2 操作要點

羊血預處理：將收集的新鮮羊血去除毛等雜質(zhì)，加入10.0g/L檸檬酸三鈉抗凝。

收集紅血球：取新鮮羊血，以5000r/min離心15min，收集紅血球沉淀；將紅血球加0.9g/100mL NaCl溶液，5000r/min離心10min，重復3次，得潔凈紅血球。

細胞破碎：取潔凈紅血球100mL，加等量去離子水攪拌溶血。

熱變性處理：將細胞裂解液中加入質(zhì)量濃度為2g/100mL CuSO4和3g/100mL ZnSO4溶液，置60℃熱處理15min，5000r/min離心15min，除去熱變性蛋白，收集上清液。

DEAE-Sephadex A-50柱層析：將透析液小心加到已用磷酸鹽緩沖液平衡好的DEAE-Sephadex A-50柱，以流速0.5mL/min進行梯度洗脫。

透析、濃縮：將洗脫液置于透析袋中，在去離子水中動態(tài)透析6～8h，并將透析液濃縮至11mL。

蛋白質(zhì)濃度和酶活力測定：以牛血清白蛋白作標準曲線，采用考馬斯亮藍染色結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度[4]；以鄰苯三酚自氧化法測定酶活力[5-6]。

1.3.2 不同糖類處理SOD

在酶活力最適溫度及底物濃度條件下，分別向4.0mL酶液中加入1.0mL的麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖和甘露糖溶液，各糖類濃度梯度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L，另取1.0mL去離子水加入等體積酶液，混勻，25℃保溫4、24、48、72、96h。將不同濃度糖類處理，25℃保溫不同時間后測定的SOD酶活力換算成相對酶活力(以不加糖類時起始酶活力為100%計)。以雙蒸水為對照，以上操作平行處理3次。

1.3.3 不同糖類處理后SOD酶活力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活力[4-5]，并以無糖類反應系統(tǒng)為對照，計算糖類存在下的相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊血SOD分離純化結(jié)果

表1 羊血SOD的分離純化Table 1 Purification steps of SOD from sheep blood

羊血SOD在DEAE-Sephadex A-50離子交換層析過程中酶活力和比活力變化如表1所示，經(jīng)層析后酶比活力達到5212.0U/mg，高于高巍等[7]用DEAE-32純化羊血SOD的結(jié)果(3871.4U/mg)。SDS-PAGE純度檢測結(jié)果如圖1所示，純化酶經(jīng)SDS-PAGE染色后顯示一條帶，表明其達到電泳純。

圖1 羊血SOD的SDS-PAGE圖譜Fig.1 Polyacrylamide gel electrophoresis of SOD from sheep blood

2.2 不同糖類處理對SOD酶活力影響

2.2.1 麥芽糖對SOD酶活力的影響

圖2 不同濃度麥芽糖對SOD酶活力的影響Fig.2 Effect of maltose on the activity of SOD

由圖2可知，在酶液中加入不同濃度的麥芽糖，保溫不同時間后，SOD酶活力有一定變化。其中麥芽糖濃度為0.1～0.2mol/L時，變化不明顯，說明低濃度麥芽糖對SOD無保護作用。麥芽糖濃度為0.3～0.5mol/L，保溫24h后，保護作用較強；保溫48h后，保護作用下降；保溫72h后，相對酶活力高于對照組，說明高濃度麥芽糖在作用較長時間后，對SOD活性有一定保護作用。

2.2.2 蔗糖對SOD酶活力的影響

圖3 不同濃度蔗糖對SOD酶活力的影響Fig.3 Effect of sucrose on the activity of SOD

由圖3可知，在酶液中加入不同濃度的蔗糖，保溫4～96h后，與對照相比，相對酶活力無明顯變化。說明蔗糖對SOD穩(wěn)定性幾乎無影響。

2.2.3 乳糖對SOD酶活力的影響

圖4 不同濃度乳糖對SOD酶活力的影響Fig.4 Effect of lactose on the activity of SOD

由圖4可知，在酶液中加入不同濃度的乳糖，保溫不同時間后，相對酶活力均高于對照，說明乳糖對SOD有一定的穩(wěn)定作用?？傮w來看，高濃度乳糖優(yōu)于低濃度乳糖。

2.2.4 海藻糖對SOD酶活力的影響

圖5 不同濃度海藻糖對SOD酶活力的影響Fig.5 Effect of trehalose on the activity of SOD

由圖5可知，在酶液中加入不同濃度的海藻糖，保溫不同時間后，相對酶活力均大于100%，最大值為137.8%，最小值為103.1%，表明其對SOD有較強的激活和穩(wěn)定作用。96h后，加入0.3mol/L海藻糖的SOD相對酶活力高于其他濃度，達到122.7%，效果最理想。

2.2.5 D-葡萄糖對SOD酶活力的影響

圖6 不同濃度D-葡萄糖對SOD酶活力的影響Fig.6 Effect of D-glucose on the activity of SOD

由圖6可知，在酶液中加入不同濃度的D-葡萄糖，保溫4～96h后，與對照相比，相對酶活力無明顯變化。說明D-葡萄糖對SOD穩(wěn)定性幾乎無影響。

2.2.6 D-果糖對SOD酶活力的影響

圖7 不同濃度D-果糖對SOD酶活力的影響Fig.7 Effect of D-fructose on the activity of SOD

由圖7可知，在酶液中加入不同濃度的D-果糖，保溫4～96h后，與對照相比，相對酶活力無明顯變化。說明D-果糖對SOD穩(wěn)定性幾乎無影響。

2.2.7 D-木糖對SOD酶活力的影響

圖8 D-木糖對SOD酶活力的影響Fig.8 Effect of D-xylose on the activity of SOD

由圖8可知，在酶液中加入不同濃度的D-木糖，保溫4～96h后，與對照相比，相對酶活力無明顯變化。說明D-木糖對SOD穩(wěn)定性幾乎無影響。

2.2.8 D-甘露糖對SOD酶活力的影響

圖9 不同濃度D-甘露糖對SOD酶活力的影響Fig.9 Effect of D-mannose on the activity of SOD

由圖9可知，在酶液中加入不同濃度的D-甘露糖，保溫4～96h后，與對照相比，相對酶活力無明顯變化。說明D-甘露糖對SOD穩(wěn)定性幾乎無影響。

3 結(jié) 論

本實驗以離子交換層析法分離純化的羊血SOD為原料，研究了不同濃度的常見雙糖和單糖在體外對SOD活性的影響。結(jié)果表明，不同濃度的海藻糖對SOD均有較強的保護作用，其中濃度在0.3mol/L時效果最佳，因此可用0.3mol/L的海藻糖作為SOD保存時的穩(wěn)定劑，使SOD保存效果更好。究其原因，一方面，海藻糖分子結(jié)構(gòu)中含有許多羥基，是一種多元醇化合物，水合能力很強，可能會使溶液中自由能向有利的方向改變[7-8]。另一方面，海藻糖的多羥基結(jié)構(gòu)使它既能通過氫鍵與酶蛋白表面分子相連，又能通過氫鍵有效地與外部水相連，因而能使酶蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，酶活力得到保護[9-11]。

糖對蛋白質(zhì)的保護作用大小有時依賴于其濃度[12]，通常在某個濃度范圍內(nèi)，保護效果隨著濃度的升高而增加[13]。本實驗中，0.5mol/L乳糖對SOD的保護效果整體優(yōu)于0.1mol/L乳糖。當某些糖達到某一濃度，作用一定時間后，保護作用達到最大值，而此后再增加濃度和保存時間，保護效果不再增加，有時反而降低[14-16]。本實驗中，麥芽糖濃度為0.3～0.5mol/L，保溫24h后，保護作用較強；保溫48h后，保護作用下降；保溫72h后，相對酶活力高于對照組，說明高濃度麥芽糖在作用較長時間后，對SOD活性有一定保護作用。

另外5種糖類對SOD活力雖無穩(wěn)定作用，但也無明顯抑制作用，說明羊血SOD可以與糖類配伍使用，即以SOD為有效成分的食品、保健食品中可使用糖類作為矯味劑。

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Effect of Carbohydrates on Activities of Superoxide Dismutase Extracted from Sheep Blood

YANG Xue-shan，YANG Xiao-pu，F(xiàn)U Wen-li (College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The activity of sheep blood superoxide dismutase (SOD) purified by DEAE Sephadex A-50 column chromatography was determined by pyrogallo autoxidation method after 4, 24, 48, 72 h and 96 h of 25 ℃ incubation in the respective presence of maltose, sucrose, lactose, fucose, glucose, D-fructose, D-trehalose, D-xylose and D-mannose under varying concentration conditions, and the corresponding relative enzyme activities were calculated. Trehalose had a remarkable activating and protecting effect on sheep SOD. High concentrations of maltose and low concentrations of lactose were conducive to stabilizing the enzyme, and other sugars tested had unobvious effect on the enzyme. Therefore, different kinds and amounts of sugar have different effects on sheep SOD.

superoxide dismutase；carbohydrate；enzyme activity

Q814

A

1002-6630(2011)07-0100-04

2010-07-27

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應用開發(fā)項目(GNSW-2010-03)

楊學山(1977—)，男，講師，碩士，主要從事生物化學與生物制品研究。E-mail：yangxs@gsau.edu.cn