姚 曄,鄧 寧,余沐洋,何建波*
(合肥工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230009)
膠束電動毛細(xì)管電泳法分離檢測5種β-內(nèi)酰胺類抗生素
姚 曄,鄧 寧,余沐洋,何建波*
(合肥工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230009)
采用毛細(xì)管電泳法,基于膠束電動模式與有機(jī)添加劑協(xié)同作用,分離檢測5種β-內(nèi)酰胺類抗生素。考察運(yùn)行緩沖液的構(gòu)成及各組分濃度、pH值、分離電壓等因素對電泳分離的影響。優(yōu)化后的電泳運(yùn)行緩沖液包含20mmol/L Na2HPO4-20mmol/L NaH2PO4 (pH8.5),20mmol/L十二烷基硫酸鈉和體積分?jǐn)?shù)25%甲醇。在18kV電壓下5種抗生素在15min內(nèi)達(dá)到基線分離。各組分線性關(guān)系良好,檢出限5.3~8.1mg/L,進(jìn)樣精密度RSD 3.8%~5.5%。研究表明,對分子結(jié)構(gòu)特別相近的抗生素,通過表面活性劑膠束準(zhǔn)固定相與有機(jī)添加劑協(xié)同作用來改善分離效果是可行的。
膠束毛細(xì)管電泳;有機(jī)添加劑;β-內(nèi)酰胺抗生素;基線分離
β-內(nèi)酰胺類抗生素在獸醫(yī)藥治療和防治牲畜疾病方面有著廣泛的應(yīng)用,但是不合理的使用會導(dǎo)致其在動物組織中殘留。長期食用抗生素殘留的食物,會導(dǎo)致人體產(chǎn)生耐藥性、破壞體內(nèi)正常菌種平衡、誘發(fā)過敏反應(yīng)等作用[1-3],因此動物性食品中的抗生素殘留問題日益受到重視。目前檢測抗生素的主要方法是液相色譜、液相-質(zhì)譜聯(lián)用和毛細(xì)管電泳等方法[4-5],其中仍在快速發(fā)展中的高效毛細(xì)管電泳法,因具有分離柱效高、試樣用量少、分析時間短、適用范圍廣等特點(diǎn),而在食品與環(huán)境安全[1-3,6-12]、生命科學(xué)、醫(yī)藥與臨床、化學(xué)與化工等眾多領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。迄今已發(fā)展出毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)、膠束電動毛細(xì)管色譜法(micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC)、毛細(xì)管等電聚焦(capillary isoelectric focusing,IEF)、毛細(xì)管等速電泳(capillary isotachophoresis,CITP)等主要模式[1],其中MECC將膠束增溶和電動移動結(jié)合起來以強(qiáng)化分離優(yōu)勢[13-15],并在準(zhǔn)固定相使用類型方面進(jìn)展迅速。
本研究對畜牧業(yè)常用的5種β-內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離檢測,包括頭孢噻呋(Ceftiofur)、頭孢唑啉(Cephazoline)、頭孢氨芐(Cephalexin)、氨芐西林(Ampicillin)和青霉素鈉(Penicillin G)。近年來一些研究者開展了這些抗生素在不同混合體系中毛細(xì)管電泳靈敏檢測的研究[7-13],但未見針對這5種抗生素共存體系的報道。該混合體系包含兩種在分子結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量和pKa值等方面差異甚微的抗生素:頭孢氨芐(C16H17N3O4S,相對分子質(zhì)量347.39,pKa1=2.5[16])和氨芐西林(C16H19N3O4S,相對分子質(zhì)量349.40,pKa1=2.4[11]),給分離帶來很大困難。本實(shí)驗(yàn)探索分子結(jié)構(gòu)特別相近抗生素的有效分離方法,選擇MECC模式的毛細(xì)管電泳技術(shù),通過表面活性劑膠束準(zhǔn)固定相與有機(jī)添加劑協(xié)同作用來改善分離效果。
1.1 試劑與儀器
氨芐西林(98%)、頭孢噻呋(87.5%)、頭孢唑啉(95%)中國藥品生物制品檢定所;青霉素鈉(98%)、頭孢氨芐(98%) 合肥博美生物科技有限公司;頭孢氨芐膠囊 哈藥集團(tuán)制藥六廠;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、甲醇均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。
CL1020高效毛細(xì)管電泳儀(配備紫外檢測器) 北京彩陸科學(xué)儀器有限公司;50μm未涂層熔融石英毛細(xì)管(有效長度50cm) 河北永年光導(dǎo)纖維廠;UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津公司;HS2060A型超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;TD5GL型離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。
1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取5種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg,青霉素鈉、氨芐西林、頭孢氨芐用水溶解,頭孢噻呋和頭孢唑啉用甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為1.00g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。于4℃冰箱內(nèi)避光保存。分別移取適量上述溶液,配制成含5種抗生素質(zhì)量濃度均為0.100g/L的混合工作液。實(shí)驗(yàn)所用溶液使用前均用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾。
1.3 電泳方法及檢測條件
采用MECC模式毛細(xì)管電泳法對5種抗生素進(jìn)行分離測定,以SDS為膠束,并以甲醇為有機(jī)添加劑。測定前毛細(xì)管清洗順序?yàn)椋?mol/L HCl溶液沖洗5min,二次蒸餾水清洗5min,1mol/L NaOH清洗10min,二次蒸餾水沖洗10min,最后用緩沖液沖洗10min。兩次測定之間用緩沖液平衡5min。高差進(jìn)樣,高度差為10cm,檢測波長200nm。通過各種參數(shù)的考察,確定優(yōu)化的電泳條件為:磷酸鹽緩沖液20mmol/L(pH8.5),SDS 20mmol/L,甲醇體積分?jǐn)?shù)25%,分離電壓18kV。
2.1 電泳條件優(yōu)化
2.1.1 電泳分離模式的選擇
由于頭孢氨芐和氨芐西林的分子結(jié)構(gòu)僅在β-內(nèi)酰胺環(huán)鄰接的雜環(huán)上存在差異,導(dǎo)致遷移速度幾近相等。在普通CZE模式中,優(yōu)化各種參數(shù)均未能實(shí)現(xiàn)兩種抗生素的分離,如圖1A所示,兩者的譜峰幾乎完全重疊在一起(電泳條件:磷酸鹽濃度20mmol/L,pH8.5,分離電壓20kV)。保持這些條件不變,向運(yùn)行液中添加20mmol/L SDS(其臨界膠束濃度8mmol/L)和體積分?jǐn)?shù)0.25的甲醇,分離效果顯著改善,如圖1B所示。在MECC模式下,帶負(fù)電的SDS膠束朝陽極方向電遷移(與電滲流相反),使膠束準(zhǔn)固定相和水醇相的遷移速度產(chǎn)生差異,而不同抗生素在兩相中的分配系數(shù)不同,導(dǎo)致遷移速度差異變大。最佳SDS濃度確定為20mmol/L。
圖1 5種抗生素的CZE模式(A)與MECC模式(B)電泳圖Fig.1 Electropherograms of five antibiotics in the modes of CZE (A) and MECC (B)
2.1.2 緩沖液pH值和濃度的選擇
緩沖溶液的pH值會影響毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基的荷電狀態(tài),從而顯著地影響電滲流的大小,因此優(yōu)先考慮優(yōu)化pH值。運(yùn)行緩沖溶液為20mmol/L磷酸鹽,20mmol/L的SDS及體積分?jǐn)?shù)0.25的甲醇。在pH7.0時,5種抗生素分離度高,但出峰時間在20~40min之間,分析時間過長;隨著pH值增大,分析時間縮短,分離度降低;在pH8.5時,出峰時間最短,在11~15min之間,同時仍能實(shí)現(xiàn)基線分離,因此最佳pH值確定為8.5。
運(yùn)行緩沖溶液的濃度會從緩沖容量、毛細(xì)管內(nèi)擴(kuò)散層的厚度、以及電泳介質(zhì)導(dǎo)電性等方面對分離產(chǎn)生影響。在其他條件固定的前提下,在5~80mmol/L范圍內(nèi)考察緩沖溶液濃度對分離度的影響,結(jié)果表明,濃度較低時分離度較好,但分析時間長;而濃度過高時電流值過大,基線不穩(wěn)。綜合考慮,選擇緩沖液濃度為20mmol/L。
2.1.3 甲醇添加量的選擇
研究表明,在緩沖液中加入有機(jī)添加劑,能明顯抑制電滲流,改善分離效果,并會使峰型變對稱,改善拖尾現(xiàn)象。保持運(yùn)行液為pH8.5、20mmol/L磷酸鹽并含20mmol/L的SDS不變,甲醇體積分?jǐn)?shù)在5%~30%之間變化,遷移時間和分離度的變化如圖2所示。可以看出,隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加,分離效果得到改善,綜合考慮分離效率和分析時間,選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%。
圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對分離時間的影響Fig.2 Effect of amount of methanol addition on migration times of fiveβ-lactam antibiotics
2.1.4 分離電壓的選擇
在確定了緩沖溶液組成的條件下,考察了分離電壓對遷移時間和分離度的影響。一般來說,提高電壓會提高電滲流速度,但也容易引起分離度下降以及焦耳熱效應(yīng)。在12~28kV電壓范圍內(nèi)考察了分離效果,選擇最佳分離電壓為18kV。
2.1.5 進(jìn)樣時間的選擇
進(jìn)樣采用高差進(jìn)樣法,高差為10cm,進(jìn)樣時間從5s開始,5s為步長進(jìn)行選擇,峰高隨著進(jìn)樣時間的延長而增加,當(dāng)進(jìn)樣時間較少時,峰高太??;進(jìn)樣時間為40s時,峰高和峰型都較好,5種試樣可以達(dá)到基線分離;當(dāng)進(jìn)樣時間超過40s時,部分物質(zhì)的檢測峰重疊,不能分離。所以進(jìn)樣時間確定為40s。在前述各種參數(shù)的優(yōu)化條件下,測得的5種抗生素電泳圖見圖3。
圖3 最優(yōu)條件下5種抗生素的電泳圖Fig.3 Electropherogram of five β-lactam antibiotics under optimum conditions
2.2 精密度、檢測線性范圍和檢出限分析
按優(yōu)化后的條件重復(fù)進(jìn)樣8次,各種抗生素的遷移時間與峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表1。
表1 遷移時間和峰面積的精密度Table 1 Precision of the determination of the migration times and peak areas of five β-lactam antibiotics
表2 線性方程與檢出限Table 2 Regression equations and detection limits for fiveβ-lactam antibiotics
2.3 實(shí)際樣品檢測
采用優(yōu)化過的方法對市售頭孢氨芐膠囊(有效成分19%)進(jìn)行檢測。稱取適量藥品粉末,加水并超聲處理40min,使藥品中的頭孢氨芐充分溶解。置于離心機(jī)中5000r/min離心10min,移取上層清液,用微孔濾頭過濾后上機(jī)檢測,結(jié)果見圖4。圖4中最強(qiáng)峰的遷移時間為13.5min,由此可以判斷其為頭孢氨芐的吸收峰。按照峰面積計算,頭孢氨芐膠囊中的有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%,結(jié)果與藥品的有效成分含量基本相符??梢姶朔椒梢杂糜趯?shí)驗(yàn)樣品的檢測。
圖4 最優(yōu)條件下頭孢氨芐膠囊的電泳圖Fig.4 Electropherogram of ampicillin capsule under optimum conditions
通過考察電泳分離模式、緩沖溶液的pH值和濃度、分離電壓、甲醇含量等重要影響因素,確定了分離頭孢噻呋、頭孢唑啉、頭孢氨芐、氨芐西林和青霉素鈉的最優(yōu)化電泳條件,實(shí)現(xiàn)了5種抗生素在15min內(nèi)完全分離,證明了通過適宜的表面活性劑膠束準(zhǔn)固定相及與有機(jī)添加劑協(xié)同作用,可以顯著改善分子結(jié)構(gòu)相近的同類型抗生素的分離效果。優(yōu)化的電泳運(yùn)行緩沖液包含20mmol/L Na2HPO4-20mmol/L NaH2PO4(pH8.5),20mmol/L SDS和體積分?jǐn)?shù)25%的甲醇。各組分線性關(guān)系良好,檢出限5.3~8.1mg/L,進(jìn)樣精密度RSD3.8%~5.5%。該方法穩(wěn)定可靠,精密度高,且操作簡便,分析成本低,為同時快速分離檢測多種β-內(nèi)酰胺類抗生素提供了一種有效方案。
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Separation and Determination of Fiveβ-Lactam Antibiotics by Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography
YAO Ye,DENG Ning,YU Mu-yang,HE Jian-bo*
(Engineering Research Centre of Bioprocess, Ministry of Education, School of Chemical Engineening, Hefei University of Technology,Hefei 230009, China)
Micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC) coupled with the addition of methanol to the running buffer was used for the separation and determination of fiveβ-lactam antibiotics, ceftiofur, cephazoline, cephalexin, ampicillin and penicillin G. The running buffer was optimized to consist of 20 mmol/L Na2HPO4, 20 mmol/L NaH2PO4 (pH 8.5), 20 mmol/L SDS and 0.25 (V/V) methanol. Under the voltage of 18 kV, baseline separation was achieved for the five antibiotics within 15 min, and their concentrations and peak areas exhibited a good linear relationship. The detection limits for these antibiotics were between 5.3 and 8.1 mg/L. The precision of the method was found to be 3.8%-5.5%. The results indicate that the combination of micellar pseudostationary phase and organic additives enables highly efficient chromatographic separation of antibiotics of very similar structures.
micelle capillary electrophoresis;organic additive;β-lactam antibiotics;baseline separation
O657.8;TS207.5
A
1002-6630(2011)16-0253-04
2010-11-10
安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(090411011);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20972038)
姚曄(1983—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)閮x器分析。E-mail:yaoye415@163.com
*通信作者:何建波(1965—),男,教授,博士,研究方向?yàn)殡姺治雠c生物電化學(xué)。E-mail:jbhe@hfut.edu.cn