吳水仙 王詠 陳勇將

浙江仙琚制藥股份有限公司 317300

液相色譜法測定注射用維庫溴銨的有關(guān)物質(zhì)

吳水仙 王詠 陳勇將

浙江仙琚制藥股份有限公司 317300

目的 ：建立注射用維庫溴銨有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。方法：采用反相HPLC法，色譜柱為Agilent Eclipse XD（BC-18, 250×4.6 mm, 5 μ m），流動(dòng)相為：pH為6.5的18.0 g·L-1的四甲基氫氧化銨的溶液－甲醇－乙腈（50：250：700），流速1.5 ml·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長為210 nm。稀釋劑：乙腈：0.01mol·L-1鹽酸溶液(1：1)；結(jié)果：雜質(zhì)A、雜質(zhì)C和雜質(zhì)E的檢測限都為0.007%、雜質(zhì)D和維庫溴銨的檢測限為0.006%, 定量限為0.02%，柱溫、流速、流動(dòng)相比例經(jīng)過微小變化不影響檢測結(jié)果。結(jié)論：本方法靈敏度高，準(zhǔn)確度高，可用于注射用維庫溴銨有關(guān)物質(zhì)的檢測。

注射用維庫溴銨；有關(guān)物質(zhì)；反相高效液相色譜法

Vecuronium Bromide for injection; Related substance; RP-HPLC

維庫溴銨為單季銨類固醇類中效非去極化肌松藥，臨床上主要作為全麻輔助用藥，用于全麻時(shí)的氣管插管及手術(shù)中的肌肉松弛；根據(jù)維庫溴銨的結(jié)構(gòu)（圖1）分析及生產(chǎn)工藝，主要的雜質(zhì)有降解物（雜質(zhì)C：3-水解物(Piperidinium, 1-[(2 β,3α,5α,16β,17β)-17-acetyloxy-3-hydroxy-2-(1-piperidinyl) androstan-16-yl]-1-methyl bromide)； 雜質(zhì)D：3,17- 水解物(Piperidinium,

1-[(2β,3α,5α,16β,17β)-3,17-dihydroxy-2-(1-piperidinyl)androstan-16-yl]-1-methyl bromide)，雜質(zhì)E：17-水解物(Piperidinium,

1-[(2 β,3 α,5 α,16 β,17 β)-3-acetyloxy-17-hydroxy-2-(1-piperidinyl) androstan-16-yl]-1-methyl bromide)）和中間產(chǎn)物雜質(zhì)A（雙酯物：3α,17β-diacetyloxy-2 β,16 β-bispiperidinyl-5 αandrostan）；為了對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，我們按藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則和ICH雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則(1)(2)，建立了注射用維庫溴銨有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。經(jīng)過方法驗(yàn)證證明該方法靈敏度高、專屬性好、準(zhǔn)確度高。維庫溴銨結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 維庫溴銨結(jié)構(gòu)

1 儀器與試藥

儀器：島津LC-20AD高效液相色譜儀(日本 島津公司)；CP225D天平（德國 賽多利斯公司）；

試藥：維庫溴銨及注射用維庫溴銨由浙江仙琚制藥股份有限公司提供、維庫溴銨系統(tǒng)適用性對(duì)照品購自歐洲藥典會(huì)；雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D和雜質(zhì)E購自美國藥典會(huì)。乙腈、甲醇為色譜純（Tedia 公司）；鹽酸和四甲基氫氧化銨為分析純，均為國產(chǎn)；水為注射用水（公司制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C-18 柱,（250×4.6 mm, 5 μ m）。

檢測波長: 210 nm

柱溫：40 ℃

流速：約1.5 ml/min

稀釋劑：乙腈：0.01 mol·L-1鹽酸溶液(1：1)

流動(dòng)相：pH為6.5的18.0 g·L-1的四甲基氫氧化銨的溶液－甲醇－乙腈（5 0：250：700）

運(yùn)行時(shí)間：25min

2.2 溶液制備

對(duì)照液（a）：取約4mg維庫溴銨EP系統(tǒng)適用性對(duì)照品（含雜質(zhì)A、E、C、D），用2mL稀釋劑溶解。

對(duì)照液（b）：取供試液1mL到50mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度。

供試品溶液：取注射用維庫溴銨樣品1支，加2mL稀釋劑溶解，搖勻,即得。

空白輔料溶液：取1支沒有加主藥的空白樣品，加2ml稀釋劑溶解，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及專屬性

對(duì)照品溶液（a）和空白輔料溶液和供試溶液按“2.1”色譜條件進(jìn)樣，維庫溴銨與各雜質(zhì)峰之間、維庫溴銨和輔料峰之間都能有效分離。結(jié)果見圖2。

圖2 維庫溴銨系統(tǒng)適用性、樣品及空白輔料色圖譜

Ⅰ-維庫溴銨系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖，Ⅱ-維庫溴銨樣品色譜圖，Ⅲ-空白輔料色譜圖

2.4 定量限、檢測限試驗(yàn)

分別取雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E和維庫溴銨適量，配制成一定濃度的溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣兩針，計(jì)算S/N值，平均信噪比為10左右，即為定量限濃度（雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E和維庫溴的定量限都為0.02%）；取定量限下的溶液3 mL，用稀釋劑稀釋至10 ml，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣兩針，計(jì)算S/ N值，平均信噪比為3左右，即為檢測限濃度（雜質(zhì)A、雜質(zhì)C和雜質(zhì)E的檢測限都為0. 007%、雜質(zhì)D和維庫溴的檢測限為0.006%）。

2.5 方法重復(fù)性試驗(yàn)：取注射用維庫溴銨樣品1支，加2 mL稀釋劑溶解，搖勻，配制6份。單個(gè)主雜質(zhì)的RSD為5.8%，雜質(zhì)總量的RSD為4.2%。

2.6 中間精密度試驗(yàn)：由兩人分別在不同的儀器上按要求測試樣品，連續(xù)測試三天，計(jì)算每次測試樣品的雜質(zhì)含量，并計(jì)算每個(gè)測試條件所得雜質(zhì)含量的平均值與RSD。檢測結(jié)果：主雜質(zhì)在0.30%～0.34%之間，平均值為0.32%，RSD為6.5%；雜質(zhì)總量在0.62%～0.69%之間，平均值為0.65%，RSD為4.3%。

2.7 溶液穩(wěn)定性：取注射用維庫溴銨樣品1支，加2 mL稀釋劑溶解，分別在如下時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣供試品溶液進(jìn)行測試：0、2、4、8、12小時(shí)；計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的雜質(zhì)及相應(yīng)的變化。結(jié)果表明，供試品溶液在2個(gè)小時(shí)后，雜質(zhì)就明顯開始增大，故在檢測時(shí)需臨用新配。

2.8 耐用性試驗(yàn)：曾用不同的流動(dòng)相比例、不同的流速、不同的柱溫，維庫溴銨與各雜質(zhì)峰之間能較好地分離，能滿足系統(tǒng)適用性要求；改換不同型號(hào)色譜柱，其色譜峰分離度不理想，故建議選用（Eclipse XDB C-18, 250×4.6 mm, 5 μm）色譜柱。

2.9 樣品檢測：取本公司的樣品3批和進(jìn)口樣品1批，按本試驗(yàn)所用方法進(jìn)行測定，樣品檢測結(jié)果見表1。

表1 維庫溴銨樣品檢測結(jié)果

3 討論

1）雜質(zhì)量的計(jì)算方法：參照EP維庫溴銨有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)(3)下和本次驗(yàn)證對(duì)各雜質(zhì)相對(duì)校正因子的計(jì)算結(jié)果，雜質(zhì)A=0.6；雜質(zhì)C=1. 4。因而采用加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算計(jì)算雜質(zhì)A和雜質(zhì)C的含量（計(jì)算雜質(zhì)A和雜質(zhì)C組分時(shí), 峰面積乘以校正因子）。

2）檢測波長：維庫溴銨及其各雜質(zhì)均沒有共軛雙鍵，在紫外區(qū)沒有強(qiáng)吸收，根據(jù)紫外掃描圖譜，在210 nm的末端紫外區(qū)有吸收，且各組分的響應(yīng)值差異不大，因而選擇210 nm為檢測波長。

3）溶劑選擇：維庫溴銨及各雜質(zhì)組分在甲醇與乙腈中易溶，注射劑中的輔料易溶于水，考慮到維庫溴銨pH值在2～3的范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，因而選取乙腈－0.01 mol·L-1鹽酸溶液(1：1)為稀釋劑。

[1]2010年版中國藥典附錄ⅪⅩ .A藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則

[2]International conference on harmonisation. ICH harmonized tripartite guideline impurities in new drug substances Q3A(R2).8～11

[3]EUROPEAN PHARMACOPOEIA 7.0 ,volume 2

Determination of related substance in Vecuronium Bromide for injection by HPLC

Wu Shuixian Wang Yong Cheng yongjiang
Zhejiang Xianju Pharmaceutical Co., ；Ltd317300

OBJECTIVE To establish a RP-HPLC method for the determination of related substance in Vecuronium Bromide for injection. METHODS The analysis was carried out on an Agilent Esclipe XDB-C18，column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), using water (pH 6.5, 18.0 g/L的四Tetramethylammonium hydroxide Beilstein)–methanol-acetonitrile (50:250:700) as the mobile phase at a flow rate of 1.5 mL/min-1 at 40 ℃, injection volume was 20 μ L and detected wavelength was 210 nm, diluent was mixture solution of acetonitrile-0.01 mol/L HCl (1: 1). RESULTS Each LOD of impurity A, impurity C and impurity E was 0.007%, the LOD of impurity E and Vecuronium Bromide was 0.006%; there was no influence on sample testing when small changes were made in the chromatographic conditions (column temperature, flow rate, and proportion of mobile phase). CONCLUSION The method was sensitive, and accurate, and it was suitable for the determination of related substance in Vecuronium Bromide.

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.14.014