吳 斌 孫銘英 肇慧君

1. 遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001；2. 鐵嶺出入境檢驗檢疫局，遼寧 鐵嶺 112400

應用原位雜交技術檢測感染斑馬魚體內的傳染性造血器官壞死病毒

吳 斌1孫銘英2肇慧君1

1. 遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001；2. 鐵嶺出入境檢驗檢疫局，遼寧 鐵嶺 112400

IHNV-DL是一株經過純化鑒定的傳染性造血器官壞死病毒。體外擴增的IHNV-DL經人工方法感染健康斑馬魚，運用原位雜交技術，對感染后出現(xiàn)明顯傳染性造血器官壞死病癥狀并進行了PCR鑒定呈陽性的病魚頭部、內臟組織切片進行IHNV-DL分子定位和檢測。結果顯示，病魚體內普遍存在病毒，腦部和內臟含量較高。本實驗建立了一種傳染性造血器官壞死病毒的檢測方法，初步確定了傳染性造血器官壞死病毒在病魚體內不同組織的分布情況。

傳染性造血器官壞死病毒；斑馬魚；人工感染；原位雜交

傳染性造血器官壞死病毒屬彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬，是傳染性造血器官壞死病的病原體，能引起鮭、鱒等經濟魚類發(fā)生流行性病害。過去IHN只流行于北美洲和歐洲一些國家，近年來隨著水生動物進出口貿易的增加，IHN已經傳入我國，并在一些地區(qū)流行，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失，是口岸魚類的第一類檢疫對象。

IHNV的傳統(tǒng)檢測方法是根據(jù)典型癥狀進行初步診斷，再通過細胞分離病毒進行確認。最后通過免疫學方法，如中和試驗和ELISA；或者分子生物學方法，如PCR方法和DNA探針法進行鑒定。

原位雜交可以對組織切片中不同細胞，不同部位靶基因進行精確定位。及特異性強、靈敏度高等特點，因此能夠作為一種很好的水生動物動物病毒定位檢測方法。

本研究利用IHNV核蛋白基因的高保守高特異性通過巢式PCR擴增出一條323bp的片段，DIG標記為探針，建立測定IHNV在病魚體各組織中分布情況的原位雜交方法。初步確定了IHNV在病魚體內存在的部位，為進一步研究IHNV的發(fā)病機理提供了基礎材料。

1 實驗材料及試劑

1.1 實驗用魚：

健康斑馬魚購自大連市鳥語花市。

1.2 病毒毒株：

IHNV-DL由遼寧出入境檢驗檢疫局實驗室純化保存。

1.3 合成分子探針的引物：

本試驗中使用的引物為擴增IHNV核蛋白基因的兩對通用引物，巢式擴增323bp的目的片段：

由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 試劑：

OMEGA凝膠回收試劑盒，羅氏地高辛DNA高效標記檢測試劑盒。

2 實驗方法

2.1 病毒液的制備：

利用RTG-2細胞對IHNV病毒的敏感性體外擴增IHNV-DL病毒，并用Reechman方法測定病毒滴度為10-5.563/0.1ml。

2.2 人工感染：

購買的斑馬魚經過一周飼養(yǎng)確定沒有病變癥狀，將20條魚分成2組（對照組和實驗組各10條）。將2組魚飼養(yǎng)在10℃水箱中，將病毒液按1:1000比例投入實驗組，適應性感染3天。在對實驗組斑馬魚進行背鰭基部肌肉注射滴度在105左右的IHNVDL病毒液5μL進行強化。注射后每天觀察記錄狀態(tài)并持續(xù)飼養(yǎng)直至實驗組出現(xiàn)明顯的病變癥狀。

2.3 病魚的PCR鑒定：

出現(xiàn)典型癥狀的病魚加入CTAB研磨，并用Trizol法提取病毒RNA。

2.4 探針的制備

2.4.1 制作模板DNA：

病毒液按照Tizol法提取病毒RNA，再按文獻[6]的方法經第一對引物進行反轉錄聚合酶鏈式反應，擴增出一條786bp的片段。PCR產物按照國標的方法經第二對引物擴增出一條323bp的片段。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按照凝膠回收試劑盒說明對PCR擴增出的323bp片段進行回收。

2.4.2 地高辛標記：

按照地高辛DNA高效標記檢測試劑盒說明，將回收的323bp片段標記成DIG-323探針。

2.4.3 探針濃度的選擇：

按照地高辛DNA高效標記檢測試劑盒說明，選擇適合的探針濃度。

2.5 切片的制作

實驗組病魚經10%甲醛固定24h后，分成頭部、內臟和尾臀三部分。經過梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后石蠟包埋。切片待檢。頭部取腦、眼處橫切片，內臟部取內臟部分中間處切片，尾臀取有最大橫切面積的切片。

2.6 原位雜交檢測

將載有病魚切片的玻片恒溫60℃ 45min水化，隨后經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；加入含100mg/L蛋白酶K的PBS，37℃消化15min；預冷的0.4%甲醛室溫固定5min；2×SSC（0.3M NaCl，0.03M枸櫞酸鈉，pH7.0）室溫漂洗5min；500μ L預雜交液（4×SSC，50%甲酰胺，0.02% BSA，0.02%聚蔗糖，0.02% PVP，5%硫酸葡聚糖）37℃預雜交30min；加入含有0.6ng/μL DIG-323探針溶液的雜交液250μL，42℃雜交2h。依次37℃，2×SSC漂洗30min,1×SSC漂洗5min，0.5×SSC漂洗5min；室溫BufferⅠ（0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl，pH 7.5）洗片5min；37℃加入500μL含5%阻斷劑的BufferⅡ阻斷15min；37℃加入500μL含有1/1000抗DIG堿性磷酸酶復合物中孵育30min；室溫BufferⅠ洗片10min，BufferⅢ（100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2，pH 9.5）平衡5min；滴加500μL顯色液（75mg/mL NBT，50mg/mL BCIP），室溫避光顯色3h；室溫BufferⅣ終止反應15min；0.5%皮斯麥棕復染色5min。梯度乙醇脫水，二甲苯置換10min。樹膠封片鏡檢?？梢婈栃孕盘柍珊谧仙?。結果用照片顯示。

同時設置陰性對照：

以對照組健康斑馬魚為材料制作切片，完全按照上述方法操作進行原位雜交檢測。

3 實驗結果

3.1 斑馬魚人工感染后的發(fā)病情況

健康斑馬魚經過傳染性造血器官壞死病毒的人工感染后，出現(xiàn)游動速度加快、應激反應強烈、體色變淺、眼球明顯突出、糜樣管狀糞便拖于肛門、腹部和尾基部有皮下出血紅斑等典型的病毒性傳染性造血器官壞死病癥狀。而對照組未出現(xiàn)變化。

3.2 巢式PCR鑒定結果

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在786bp的位置上病魚樣品提取的RNA沒有相應擴增條帶（圖1），標準陽性對照與引物預期擴增條帶大小相符。

圖1 第一對引物PCR產物電泳圖

將第一對引物擴增出的PCR產物在經過第二對引物的巢式擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，病魚樣品在323bp的位置上有擴增條帶（圖2），并與標準陽性對照大小一致。結果說明，實驗組斑馬魚已經感染了IHNV病毒。

圖2 第二對引物巢式PCR產物電泳圖

3.3 探針的制備

病毒RNA經巢式PCR擴增出的323bp片段經膠回收(圖3)后按照羅氏地高辛DNA高效標記檢測試劑盒的說明進行標記。DIG標記濃度為100ng/μL。

圖3 制備DIG-323探針的模板膠回收圖

3.4 探針濃度的測定

在硝酸纖維素（NC）膜上進行的斑點印記雜交反應選擇探針濃度的結果表明，DIG-323探針對同源靶基因的檢測靈敏度在探針濃度為0.1ng/μL時仍有明顯的紫色雜交斑點。本研究中選擇使用產生藍紫色斑點中探針濃度較低的濃度，0.6ng/μL作為原位雜交檢測中使用的探針濃度。

圖4 探針濃度斑點印記雜交結果

3.5 原位雜交檢測結果

感染的斑馬魚原位雜交檢測結果（圖5）與對照組健康斑馬魚原位雜交檢測結果（圖6）對比顯示，在腦、肌肉、腹部內膜和內臟組織切片中均檢測到了深紫色的陽性信號斑點。其中，整個頭部（A）、腹部內膜（E）和內臟部分（F）的陽性斑點較多，肌肉組織中也可觀察到陽性信號。

圖5 實驗組病魚組織切片DIG-323探針原位雜交檢測結果

圖6 對照組健康魚組織切片DIG-323探針原位雜交檢測結果

4 討論

核酸原位雜交技術有嚴格的要求，組織的預處理、切片厚度、使用標記的探針濃度、檢測的靶基因的量、雜交的溫度、梯度洗液的濃度及pH都要求適當、穩(wěn)定，否則會影響雜交效果。其中，探針模板的長度和探針的濃度對實驗結果起到至關重要的作用。一般認為，用于原位雜交的探針長度以50～300bp為最佳，這樣的探針通透性好并且雜交效率高；雜交反應時，探針的濃度過高不但造成浪費，而且會使背景顏色很深。

原位雜交技術將分子生物學與組織學相結合，從細胞水平上在原位研究特異性核酸同時定位靶基因的分布，敏感直觀。為病毒的組織細胞定位提供了一個有效的方法，有助于研究病毒的發(fā)病機理。

本研究應用原位雜交方法測定了人工感染的健康斑馬魚組織切片中的傳染性造血器官壞死病毒的主要分布部位。利用IHNV核蛋白基因的高保守高特異性，使用通用引物擴增出標準病毒的一段323bp的片段作為模板，通過將模板變性將模板標記成探針DIG-323。本實驗結果顯示，IHNV病毒原位雜交斑點顏色呈亮藍紫色明顯區(qū)別于經過俾斯麥棕復染的組織顏色。說明本研究中選擇使用的探針濃度0.6ng/μL具有較高的敏感性，并且背景顏色不會過深，實驗陽性結果容易判定。實驗結果表明，IHNV病毒在人工感染的斑馬魚體內普遍分布但是含量較低，并且在于腦、腹部內膜和內臟組織中的含量高于在肌肉組織中的含量。本研究中IHNV在斑馬魚組織切片中原位雜交檢測結果對今后研究IHNV的治病機理提供了基礎資料。

[1]何玉英, 李健, 劉萍, 等. 原位雜交技術及其在水產養(yǎng)殖中的應用[J]. 海洋水產研究.2005, 26(1): 74-79

[2]GB/T 15805. 2-2008[S]

[3]蘇慧慈. 原位雜交[M]. 北京: 中國科學技術出版社. 1994

[4]徐云遠, 種康, 許智宏, 等. RNA原位雜交使用技術[J]. 植物學通報.2002, 19(2): 234-238

[5]陳曉艷, 何建國. 原位雜交技術在斜帶石斑魚神經壞死病毒檢測中的應用[J].海洋科學. 2008, 32(6): 1-4

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.07.128

國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技項目（項目編號：2010IK003）