商 穎，許文濤，，* ，元延芳，梁志宏，石 慧，翟志芳，張雅楠，羅云波，，黃昆侖，，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083;2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京100083)

一種檢測(cè)肉品的新型通用單引物多重PCR技術(shù)

商 穎1，許文濤1，2，*，元延芳2，梁志宏2，石 慧1，翟志芳1，張雅楠2，羅云波1，2，黃昆侖1，2，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083;2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京100083)

在市場(chǎng)中，牛、羊肉中摻雜價(jià)格便宜的豬肉，以次充好的欺騙行為屢見不鮮，而且近些年來出現(xiàn)瘋牛病、禽流感等疾病，肉品的種屬鑒定變得至關(guān)重要。隨著分子生物學(xué)的深入研究，多重PCR技術(shù)得到了飛快的發(fā)展，但是其擴(kuò)增效率和檢測(cè)限達(dá)不到理想要求。為尋找快速、靈敏、特異的檢測(cè)生肉品種的方法，在普通多重PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展了一種新的通用單引物多重PCR(CSP－M－PCR)技術(shù)，該方法的體系中，所有目的片段共用一樣的上游引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)限可達(dá)5μmol/L。此方法不僅彌補(bǔ)了普通多重PCR擴(kuò)增效率較低、檢測(cè)限不理想的缺點(diǎn)，還提高了檢測(cè)的靈敏度、降低了檢測(cè)的成本。

多重PCR，通用單引物，同時(shí)檢測(cè)，肉品種屬

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人民消費(fèi)水平的逐漸提高，消費(fèi)者對(duì)食品質(zhì)量與安全性的要求也越來越高，在國內(nèi)及國際貿(mào)易中，牛、羊肉中摻雜價(jià)格便宜的豬肉，以次充好的欺騙行為屢見不鮮，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益［1］，而且當(dāng)肉品加工成肉餡，單憑其外觀更難鑒別是哪個(gè)品種［2］。近些年瘋牛病、禽流感等疾病的出現(xiàn)，生肉制品的摻假摻雜現(xiàn)象不僅涉及到消費(fèi)者的宗教(如在清真食品中摻入豬肉、豬油)、經(jīng)濟(jì)等問題，也涉及到消費(fèi)者的健康和市場(chǎng)監(jiān)管問題［3］，因此急需一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法以對(duì)肉制品成分進(jìn)行種屬鑒定。20世紀(jì)80年代，國外開始對(duì)肉的種屬鑒定進(jìn)行研究，采用的方法主要有DNA雜交、免疫擴(kuò)散和等電點(diǎn)聚焦［4］等，這些方法大都存在著成本高、工作量大、對(duì)檢測(cè)對(duì)象要求高等缺點(diǎn)［5］。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，也被應(yīng)用到肉制品品種的檢測(cè)中［6］。由于單一PCR檢測(cè)成本高，肉品中可能存在其它品種，單重PCR已經(jīng)滿足不了現(xiàn)有的要求，進(jìn)而出現(xiàn)了多重PCR技術(shù)，其是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多條目的DNA片段的方法［7］。但是，多重PCR中也存在一些不足，如體系中存在多對(duì)引物而導(dǎo)致的擴(kuò)增效率較低、不同模板之間的擴(kuò)增效率不一致等［8］，這些都限制了此項(xiàng)技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用。因此，建立一種能快速、靈敏、特異的檢測(cè)生肉品種的檢測(cè)方法一直是有待解決的難題。本研究在普通多重PCR的基礎(chǔ)上建立了一種通用單引物多重PCR技術(shù)(common single primer multiplex polymerase chain reaction，CSP－MPCR)，此技術(shù)不僅可以避免普通多重PCR擴(kuò)增效率低的缺點(diǎn)，而且可以降低反應(yīng)體系的檢測(cè)限和成本，提高反應(yīng)靈敏度，從而為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)肉品種屬提供一種新方法。

表1 引物序列

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞肉、牛肉、羊肉和豬肉 本研究采用的4種生肉材料，均購自本地市場(chǎng)，將4種生肉材料分別用絞肉機(jī)絞碎，按照每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟的要求，將肉品按照一定比例混合;2U Taq DNA聚合酶 大連寶生物公司;Pico－GreenTM雙鏈DNA定量試劑盒 購于荷蘭Molecular Probes公司。

FL×800微型模塊熒光接受器 美國Bio－Tek儀器公司;收集到的信號(hào)采用KC4(2000)軟件 美國Bio－Tek儀器公司;Biometra? PCR 德國Biometra公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 肉制品混合物DNA的提取參考Sambrook等［9］的方法，將提取的 DNA保存在 TE(10mmol/L Tris－HCl pH8，0.1mmol/L EDTA)溶液中［10］，用以后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)中的模板。

采用Pico－GreenTM雙鏈DNA定量試劑盒對(duì)DNA模板定量，F(xiàn)L×800微型模塊熒光接受器接受熒光信號(hào)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，收集到的信號(hào)采用KC4(2000)軟件分析。根據(jù)DNA分子的質(zhì)量和平均大小來計(jì)算DNA摩爾數(shù)。

1.2.2 CSP－M－PCR原理及反應(yīng)體系 在此研究中，CSP引物序列根據(jù)雞肉、牛肉、羊肉和豬肉線粒體細(xì)胞色素b DNA序列保守區(qū)設(shè)計(jì)［11］，以作為PCR反應(yīng)的上游引物。將設(shè)計(jì)好的CSP序列連接在種屬特異性下游引物的5'端，以作為CSP－M－PCR反應(yīng)體系中的下游引物(記為種屬特異性引物－R)，具體的引物序列見表1。每個(gè)引物對(duì)經(jīng)過Biometra? PCR選擇出最合適的退火溫度。

在CSP－M－PCR反應(yīng)體系中，加入的引物有:CSP、雞－R、牛－R、羊－R 和豬－R。其中:CSP是根據(jù)以上四種肉品線粒體細(xì)胞色素b DNA序列保守區(qū)而設(shè)計(jì)的，因此對(duì)雞、牛、羊和豬的DNA片段都能結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增。在反應(yīng)的前幾個(gè)循環(huán)，主要是作為上游引物的CSP和下游引物中的種屬特異性引物－R與DNA片段發(fā)生特異性結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增，得到片段大小不同的產(chǎn)物。當(dāng)5'端連有CSP的下游引物用完之后，擴(kuò)增產(chǎn)物得到一定程度的積累，下游片段也擴(kuò)增出含有CSP互補(bǔ)的序列，此時(shí)，CSP既可以作為上游引物也可以作為下游引物，以得到的產(chǎn)物為模板進(jìn)行序列擴(kuò)增，即可得到由通用單引物CSP擴(kuò)增的片段大小不同的目的條帶［12］。在實(shí)驗(yàn)過程中，首先通過兩組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)此原理的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證，即一組PCR反應(yīng)體系加入CSP上游引物和普通特異性下游引物，另一組PCR體系加入CSP上游引物和特異性下游引物－R。

反應(yīng)體系為 30μL，其中包含:10mmol/L Tris－HCl(pH 8，50mmol/L KCl)、l.5mmol/L MgCl2、dNTP mix(每個(gè)堿基為50μmol/L)、引物、2U Taq DNA聚合酶和適量的模板，其余體積用雙蒸水補(bǔ)齊。將混合引物設(shè)置在不同的比例來優(yōu)化反應(yīng)步驟和退火溫度。擴(kuò)增結(jié)束后，取12μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行分離。

1.2.3 引物靈敏度測(cè)試 在此部分的研究中做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以測(cè)試通用單引物的靈敏度。兩組PCR反應(yīng)的條件相同，熱混環(huán)條件根據(jù)引物的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。

CSP和種屬特異性引物的比例分別為 1∶1、1∶0.1、1∶0.01 和 1∶0.001(其中“1”為 0.5mmol/L);CSP和種屬特異性引物－R的比例與之相同。以四種肉制品的等量混合物中提取的DNA作為模板，體系中模板的加入量為10ng。

1.2.4 優(yōu)化CSP－M－PCR反應(yīng)體系 分別將四種肉制品中的1種到4種混合，提取的混合肉制品的DNA，并且作為PCR反應(yīng)的模板，依次進(jìn)行單重到四重CSP－PCR，模板的加入量為10ng。通過改變引物CSP、雞－R、牛－R、羊－R 和豬－R 加入的比例優(yōu)化反應(yīng)體系中引物的加入量，擴(kuò)增的熱循環(huán)條件與1.2.3優(yōu)化的結(jié)果相同。

1.2.5 CSP－M－PCR反應(yīng)檢測(cè)限的測(cè)試 為了測(cè)試CSP－M－PCR反應(yīng)對(duì)單一肉品的檢測(cè)限，將四種肉品按一定比例混合(將0.1g/kg牛肉和50g/kg羊肉，0.5g/kg牛肉和10g/kg羊肉，2g/kg牛肉和2g/kg羊肉，10g/kg牛肉和0.5g/kg羊肉，50g/kg牛肉和0.1g/kg羊肉與其它兩種等質(zhì)量混合的肉品按一定比例再混合)，使得混合物中的牛肉所占的比例依次為0.1、0.5、2、10和50g/kg，提取混合物的基因組作為 PCR反應(yīng)模板，加入量為10ng。CSP－M－PCR反應(yīng)熱循環(huán)條件同1.2.4。因每種生肉在CSP－M－PCR反應(yīng)中所占的比例都不同，所以能得到顯著不同的擴(kuò)增效率，因此可以測(cè)試該反應(yīng)體系的檢測(cè)限。

2 結(jié)果與討論

2.1 CSP－M－PCR反應(yīng)可行性驗(yàn)證

經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)過程的優(yōu)化，最終確定PCR擴(kuò)增反應(yīng)的熱循環(huán)條件為:95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸 30s，35 個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸 10min。引物濃度為15pmol。由圖1、圖2可知，每對(duì)引物都可得到相應(yīng)的目的條帶，沒有非特異性條帶出現(xiàn)，而且二者的擴(kuò)增效率相似。引物CSP和種屬特異性引物－R得到的產(chǎn)物較CSP與種屬特異性引物的產(chǎn)物片段大38bp，是由于種屬特異性引物－R的5'端連接著與CSP相同的一段序列(38bp)，因此得到的目的片段較后者大。

圖1 CSP和種屬特異性引物可行性驗(yàn)證

圖2 CSP和種屬特異性引物－R可行性驗(yàn)證

2.2 引物靈敏度測(cè)試

種屬特異性引物和種屬特異性引物－R的靈敏度測(cè)試采用含有豬肉和雞肉混合物的二次抽樣方法進(jìn)行測(cè)試。反應(yīng)的熱循環(huán)條件為:95℃變性30s，退火溫度為 70℃ 10s、60℃ 30s，72℃延伸 30s;95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，25 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。結(jié)果如圖3、圖4所示。

由圖3～圖4可知，當(dāng)特異性下游引物濃度降低到5μmol/L時(shí)，已經(jīng)得不到可見的目的條帶，隨特異性下游引物濃度的減少，擴(kuò)增效率依次降低。而當(dāng)特異性引物－R的濃度降低到5μmol/L，依然可以得到清晰的目的條帶。因此，CSP－M－PCR反應(yīng)的靈敏度有顯著地提高。

圖3 CSP與豬肉特異性引物靈敏度測(cè)試

圖4 CSP與雞肉特異性引物靈敏度測(cè)試

2.3 CSP－M－PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

為了找到最佳CSP－M－PCR的反應(yīng)體系，進(jìn)行單重到四重PCR進(jìn)行優(yōu)化。其中單重和二重PCR反應(yīng)結(jié)果見圖5，三重和四重CSP－PCR的結(jié)果如圖6所示。經(jīng)過優(yōu)化的結(jié)果為:引物CSP、雞－R、牛－R、羊－R 和豬－R 的加入比例為 1∶0.01∶0.01∶0.01∶0.01(其中“1”為0.5mmol/L)。

2.4 CSP－M－PCR對(duì)肉品的檢測(cè)限

測(cè)試CSP－M－PCR反應(yīng)體系中對(duì)四種肉品混合物的檢測(cè)限，將雞肉、牛肉、羊肉和豬肉按不同比例混合，可以得到每種肉DNA的不同混合物，即每種肉品的擴(kuò)增效率也不同，由此可以得到CSP－M－PCR的檢測(cè)限，結(jié)果如表2所示。

圖5 單重及二重CSP－PCR反應(yīng)

圖6 三重和四重CSP－PCR反應(yīng)

表2 CSP－M－PCR反應(yīng)對(duì)肉品的檢測(cè)限

由表2可知，當(dāng)實(shí)驗(yàn)2和4號(hào)之間時(shí)，都能得到可見的目的條帶，而當(dāng)牛羊肉中有一種的質(zhì)量比例在0.5g/kg以下時(shí)，都得不到相應(yīng)的目的片段。由此可知，此反應(yīng)體系對(duì)單一肉品的最低檢測(cè)限為0.5g/kg。

3 結(jié)論

本文研究出一種同時(shí)檢測(cè)多種肉品的新技術(shù)，即通用單引物多重PCR。在此反應(yīng)中，通用引物CSP的設(shè)計(jì)是至關(guān)重要的，因?yàn)橐飳?duì)特異性和Tm值的要求要比普通PCR嚴(yán)格。經(jīng)過一系列反應(yīng)條件的優(yōu)化，得出最佳的反應(yīng)熱循環(huán)條件為:95℃變性30s，退火溫度為 70℃ 10s、60℃ 30s，72℃ 延伸 30s;95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃ 延伸 30s，25 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。在反應(yīng)的前10個(gè)循環(huán)，主要是CSP做為上游引物，種屬特異性引物－R做為下游引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。當(dāng)種屬特異性引物－R用盡后，得到的目的片段上也有與CSP互補(bǔ)的片段，CSP也可以做為下游引物進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。優(yōu)化的反應(yīng)條件不僅能夠降低錯(cuò)配率，而且能提高反應(yīng)的靈敏度。

CSP－M－PCR反應(yīng)中，當(dāng)加入的特異性引物量降低到5μmol/L，已看不到清楚的目的條帶，而當(dāng)加入的下游引物為特異性引物－R時(shí)，雖然含量為5μmol/L，依然可以得到可見的目的條帶，大大地節(jié)約了新型引物的加入量，而且消除了不同特異性引物之間性質(zhì)的差異。

如何在短時(shí)間內(nèi)更多地檢測(cè)到肉品的種類和摻假摻雜情況，一直是我國學(xué)者重點(diǎn)研究的對(duì)象，這不僅關(guān)乎到經(jīng)濟(jì)和合理的市場(chǎng)監(jiān)管問題，也涉及到宗教和健康等問題。CSP－M－PCR這種新方法不僅滿足了快速檢測(cè)和較低的檢測(cè)限，而且成本還較低，為我國的新型檢測(cè)技術(shù)提供了許多參考價(jià)值。

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Novel common single primer multiplex PCR for detecting various meat species simultaneously

SHANG Ying1，XU Wen－tao1，2，*，YUAN Yan－fang2，LIANG Zhi－h(huán)ong2，SHI Hui1，ZHAI Zhi－fang1，ZHANG Ya－nan2，LUO Yun－bo1，2，HUANG Kun－lun1，2，*

(1.College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.The Supervision，Inspection ＆ Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

Nowadays in the market，add cheap pork into beef or mutton，sell seconds at best quality prices always happen.In recent years，since the emergence of some diseases，such as mad cow disease，avian flu and so on，meat species identification becomes more and more critical.With in－depth study of molecular biology，multiplex PCR technology has made a rapid development，however，the low amplification efficiency and detection limit don’t live up to the satisfactory requirements.In order to find a quick，sensitive and specific detection of meat species，a novel common single primer multiplex PCR(CSP－M－PCR)technique on the basis of traditional multiplex PCR was developed.In the system of this method，only use common single primer to amplify all of the templates，the limit of detection is 5μmol/L target DNA.This technology not only makes up the shortcomings of traditional multiplex PCR，but also enhances the detecting sensitivity and reduces test costs.

multiplex PCR;common single primer;simultaneous detection;meat species

TS207.5

A

1002－0306(2011)09－0416－04

2010－09－15 *通訊聯(lián)系人

商穎(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品安全。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2006AA10Z440);國家自然基金(30800770)和轉(zhuǎn)基因生物重大專項(xiàng)(2008ZX08012－001)。