李潔慧，單曉麗，宮春波，孫 濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與科學(xué)工程學(xué)院，山東青島266109)

產(chǎn)紅色素酵母菌的分離、鑒定及其基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化

李潔慧，單曉麗，宮春波*，孫 濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與科學(xué)工程學(xué)院，山東青島266109)

利用微生物平板分離方法，從花生渣土、椰汁土中分離、篩選得到3株產(chǎn)紅色素菌株。光學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)菌體呈現(xiàn)橢球形，大小約為(2.5～5.0)μm×(5.5～8.0)μm;無(wú)性繁殖為出芽生殖。根據(jù)菌體形態(tài)特征、群體形態(tài)特征和生理生化反應(yīng)，3株菌株歸屬于紅酵母屬(Rhodotorula)，命名為紅酵母FS－1(Rhodotorula sp.FS－1)。依據(jù)OD值法、DCW法測(cè)得紅酵母FS－1的典型生長(zhǎng)曲線為:延滯期，0～8h;對(duì)數(shù)期，8～24h;穩(wěn)定期，24～34h;衰亡期為34h后。紅酵母 FS－1能夠較好地利用豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基作為其發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基產(chǎn)生紅色色素。

酵母菌，紅色色素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基

色素作為一種重要的食品添加劑，在食品行業(yè)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，按來(lái)源通常分為合成色素、仿天然色素和天然色素［1］，天然色素因其具有高安全性、營(yíng)養(yǎng)保健作用并能更好地呈現(xiàn)天然物質(zhì)的顏色而越來(lái)越受到人們的關(guān)注。很多食品級(jí)安全的真菌、細(xì)菌等微生物在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生不同顏色和結(jié)構(gòu)的色素，為開發(fā)微生物源性食品著色劑提供了良好的來(lái)源。另外，微生物生長(zhǎng)能夠克服季節(jié)、氣候等限制因素，利用發(fā)酵獲得大量目標(biāo)色素，因此研發(fā)微生物源性色素日益受到重視。酵母菌是一類單細(xì)胞的食品級(jí)安全真核微生物，以其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、繁殖快速、相對(duì)于細(xì)菌更安全等優(yōu)點(diǎn)被人們普遍接受并廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，利用酵母菌生產(chǎn)天然色素在食品添加劑行業(yè)中具有極其廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腐爛花生皮土壤、花生油渣土壤 采自萊陽(yáng)花生油廠;椰子汁培育土壤 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)地;大豆粉、豆芽汁、玉米面 市售;培養(yǎng)基［2－4］分離培養(yǎng)基:PDA固體培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基、麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、無(wú)碳培養(yǎng)基、無(wú)氮培養(yǎng)基、缺維生素培養(yǎng)基、高滲透壓培養(yǎng)基、產(chǎn)類淀粉培養(yǎng)基、脲素培養(yǎng)基、醋酸瓊脂培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、碳酸鈣培養(yǎng)基、產(chǎn)酯培養(yǎng)基;5%孔雀石綠染液，盧哥氏碘液，結(jié)晶紫染液，番紅(沙黃)染液等其他常規(guī)試劑。

LXJ－Ⅱ型離心機(jī)、LXJ－Ⅱ離心沉淀機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠;SPX型智能生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;JY2002電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司;UV－2100分光光度計(jì) 尤尼科(上海)儀器有限公司;Anke Tall－16臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;攝像顯微鏡 BK－DM320。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物的分離方法［5］稱取土壤樣本置于無(wú)菌水中，配制成不同稀釋梯度的菌懸液，選擇合適的稀釋梯度，經(jīng)平板分離初篩，挑取目標(biāo)菌落轉(zhuǎn)接種斜面培養(yǎng)基，備用。

1.2.2 菌種的鑒定方法 參考文獻(xiàn)［2－6］中推薦的方法對(duì)菌株的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、有無(wú)假菌絲、生殖方式等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察，利用碳源發(fā)酵、同化實(shí)驗(yàn)、37℃條件生長(zhǎng)、高滲透壓培養(yǎng)基生長(zhǎng)、無(wú)維生素培養(yǎng)基生長(zhǎng)、醋酸生長(zhǎng)、產(chǎn)類淀粉、產(chǎn)酸、產(chǎn)酯、分解脲素、明膠液化等生理生化反應(yīng)進(jìn)行生理生化測(cè)定，并對(duì)照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》初步鑒定目標(biāo)菌株的歸屬。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定［7］在裝有80mL豆芽汁培養(yǎng)基的錐形瓶中按8%的接種量接入酵母菌的菌懸液，28℃、140r/min 振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)后第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、40、43、47、51、55h分別在560nm波長(zhǎng)下以不接菌的培養(yǎng)液為空白對(duì)照測(cè)定其OD值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制酵母菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 生物量的測(cè)定方法［8］OD值法:依據(jù)酵母菌的生物量與發(fā)酵液的吸光度呈正相關(guān)，在波長(zhǎng)560nm處測(cè)定其吸光度(比色杯直徑為1cm)，得OD560。

干細(xì)胞重法(DCW法):離心前將離心管放入鼓風(fēng)干燥箱中烘干若干小時(shí)，自然冷卻，分析天平稱重。取5mL發(fā)酵液置于離心管中，4000r/min離心10min，棄上清，85℃烘干12h，稱重，用差量法得干細(xì)胞重。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體的分離、純化

從腐爛花生皮的土壤、花生油渣土和椰汁培育土壤中經(jīng)平皿劃線分離法，分別得到呈粉紅色、淡黃色、橘紅色，黏稠、濕潤(rùn)，表面平坦無(wú)褶皺，邊緣整齊的菌落。挑取其中3株粉紅色菌落作為篩選的目的菌株，分別編號(hào)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，斜面冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌體個(gè)體形態(tài)、群體形態(tài)觀察

將菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在PDA固體培養(yǎng)基上點(diǎn)接種，28℃，72h培養(yǎng)，菌落均呈橘紅色圓形菌落，菌落直徑在1.5mm左右，中央略微隆起，質(zhì)地均勻，無(wú)褶皺，邊緣整齊，黏稠，隆起于培養(yǎng)基表面，易挑起，正反面顏色一致(圖1)。菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d后，可看到發(fā)酵液呈現(xiàn)橘黃色，底部有橘紅色沉淀物，靜止沉淀后得到橘紅色菌體沉淀物。

菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在光學(xué)顯微鏡1000倍下觀察，細(xì)胞呈橢圓形，大小約為(2.5～5.0)μm ×(5.5～8.0)μm，無(wú)性繁殖方式為出芽生殖(圖2);產(chǎn)孢培養(yǎng)基上獲得的菌體，簡(jiǎn)單美藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡1000倍下觀察，能夠推定菌株能在產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上產(chǎn)生子囊孢子(圖3);假菌絲實(shí)驗(yàn)和擲孢子形成實(shí)驗(yàn)表明，該菌株不產(chǎn)假菌絲，亦不產(chǎn)生擲孢子。

2.3 菌株生理生化特征及鑒定結(jié)果

圖1 菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ豆芽汁固體培養(yǎng)基平板菌落特征

圖2 光學(xué)顯微鏡下菌體個(gè)體形態(tài)及其出芽生殖(1000倍)

圖3 產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上產(chǎn)生子囊孢子(1000倍)

參照文獻(xiàn)［2－4］，按照鑒定要求對(duì)菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、同化實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酯實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，可知菌株能夠以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、半乳糖以及乙醇作為碳源，同化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性;但發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性;菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ可以利用硫酸銨、硝酸鉀，37℃均能夠生長(zhǎng)，產(chǎn)酯不產(chǎn)酸。

表1 菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ生理生化鑒定結(jié)果

綜合菌體的個(gè)體形態(tài)、群體形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果，對(duì)照《酵母菌的特征和鑒定手冊(cè)》［2］分析，發(fā)現(xiàn)菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ屬于同一種酵母菌，鑒定為紅酵母屬(Rhodotorula)，初步判定為一株紅酵母(Rhodotorula sp.)，命名為紅酵母 FS－1(Rhodotorulasp.FS－1)。

2.4 菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及其結(jié)果

根據(jù)OD值法，紅酵母FS－1生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果見圖4;依據(jù)干細(xì)胞重法(DCW法)，紅酵母FS－1生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果見圖5。圖4、圖5表明，前8h酵母菌生長(zhǎng)曲線趨于平緩，生長(zhǎng)緩慢，處于菌體生長(zhǎng)的延滯期;8～24h酵母菌的OD值、DCW值曲線增長(zhǎng)迅速，呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，為菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期;24～34h后菌體生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，生長(zhǎng)曲線較平緩，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)處在穩(wěn)定期;34h后OD值、DCW值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，為菌體生長(zhǎng)的衰亡期。在振蕩培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，橘紅色色素在34h后逐漸開始產(chǎn)生，符合微生物產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的一般規(guī)律［9］。DCW法測(cè)定的曲線趨勢(shì)圖與OD值法測(cè)定的曲線較吻合，相互印證了其生長(zhǎng)規(guī)律。

圖4 紅酵母FS－1的典型生長(zhǎng)曲線(OD值法)

圖5 紅酵母FS－1的典型生長(zhǎng)曲線(DCW法)

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的初步篩選結(jié)果

2.5.1 不同發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)紅酵母FS－1生物量的影響 以PDA液體培養(yǎng)基、豆芽汁、麥芽汁培養(yǎng)基為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，28℃、72h培養(yǎng)紅酵母FS－1，測(cè)得的OD值和DCW值結(jié)果見圖6，可以看出紅酵母FS－1在3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生物量差別不大，PDA液體培養(yǎng)基獲得的酵母生物量較大，麥芽汁培養(yǎng)基次之，豆芽汁培養(yǎng)基較少，但差距并不顯著。然而，就色素生產(chǎn)而言，豆芽汁培養(yǎng)基中的色素鮮亮、雜質(zhì)少。另外，PDA液體培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基中含有大量沉淀物不易去除，且影響色素顏色及其后期提取、純化。因此，綜合考慮，選擇豆芽汁培養(yǎng)基作為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.5.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同碳源對(duì)紅酵母FS－1生長(zhǎng)的影響 以豆芽汁培養(yǎng)基為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測(cè)定葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖和甘露醇五種碳源對(duì)紅酵母FS－1生物量的影響，結(jié)果見圖7，表明將葡萄糖、半乳糖、蔗糖作為碳源時(shí)，紅酵母FS－1生長(zhǎng)的OD值差異不顯著，而DCW值則以蔗糖為最大，并且72h時(shí)，各碳源的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基均有橘紅色色素產(chǎn)生，由此確定蔗糖為紅酵母FS－1發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的

圖6 紅酵母FS－1在3種發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況最佳碳源。

圖7 紅酵母FS－1在不同碳源發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

3 討論

運(yùn)用微生物平板劃線分離法，從腐爛花生皮土、花生油渣土以及椰汁培育土樣中共分離到3株產(chǎn)橘紅色色素菌株，通過(guò)菌體的個(gè)體形態(tài)特征、群體形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果，對(duì)照《Yeasts:Characterisitics and Identification》分析，確認(rèn)分離到的菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ屬于紅酵母屬(Rhodotorula)，初步判定為一株紅酵母(Rhodotorula sp.)，命名為紅酵母FS－1(Rhodotorula sp.FS－1)。酵母菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)為0～8h為延滯期，8～24h 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24～34h 為穩(wěn)定期，34h 后為衰亡期，這與蔡金星［10］、王秋菊［7］、陳龍泉［11］等人研究的酵母菌生長(zhǎng)趨勢(shì)基本吻合。本研究確定紅酵母FS－1生長(zhǎng)的最優(yōu)碳源為蔗糖，這與王歲樓［12］、倉(cāng)一華［13］、張琇［14］等人的研究結(jié)果一致。胡萍［15］、張卉［16］等人則發(fā)現(xiàn)葡萄糖為產(chǎn)類胡蘿卜素酵母菌發(fā)酵的最佳碳源。在諸多研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和蔗糖對(duì)產(chǎn)類胡蘿卜素酵母菌的生長(zhǎng)影響差別不大，在工業(yè)生產(chǎn)中，為降低生產(chǎn)成本，通常選擇葡萄糖為最佳發(fā)酵碳源。

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Isolating and identifying red pigment produced starin and optimizing fermentation fountation medium

LI Jie－h(huán)ui，SHAN Xiao－li，GONG Chun－bo*，SUN Tao

(College of Food Science and Engineering，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China)

Three prouduced red pigment strains were scaned by using the microorganism plate pure isolation technique from peanut dregs pollution soil，peanut oil dregs pollution soil and coconut milk pollution soil.The three isolated strains belonged to Rhodotorularby morphologicalfeature and physiology and biochemistry characteristics，it was called Rhodotorula sp.FS－1.Rhodotorula sp.FS－1 appeared to elliptocytosis，was(2.5～5.0)μm ×(5.5～8.0)μm.Rhodotorula sp.FS－1 asexual reproduction was budding.By determining turbidimetry(OD)and dry cell weight(DCW)，Rhodotorula sp.FS－1 growth curve was divided into four growth phase，respectively was lag phase 0～8h，exponential phase 8～24h，stationary phase 24～34h，death phase or decline phase behind 34h.The fermentation fountation medium of Rhodotorula sp.FS－1 for producing red pigment was bean sprouts medium with sucrose.

yeast;red pigment;fermentation fountation medium

TS201.3

A

1002－0306(2011)09－0227－04

2010－09－17 *通訊聯(lián)系人

李潔慧(1987－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:食品微生物及發(fā)酵工程。