徐偉麗，李啟明，汪家琦，馬 鶯，*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090;2.新希望乳業(yè)控股有限公司技術(shù)中心，四川成都610023)

麥芽糊精基因組DNA不同提取方法的比較

徐偉麗1，李啟明2，汪家琦2，馬 鶯1，*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090;2.新希望乳業(yè)控股有限公司技術(shù)中心，四川成都610023)

采用不同方法對麥芽糊精基因組DNA進(jìn)行提取，從中選取滿足麥芽糊精材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測的最好的DNA提取方法。以市售麥芽糊精為材料，分別采用CTAB、SDS和異硫氰酸胍3種方法提取基因組DNA，比較不同方法的提取效果。光密度檢測結(jié)果顯示，異硫氰酸胍法的提取量和純度均優(yōu)于SDS法和CTAB法;瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示異硫氰酸胍法提取的基因組DNA譜帶清晰、重復(fù)性好，SDS法和CTAB法提取的基因DNA觀察不到譜帶;3種方法提取的麥芽糊精基因組DNA都能夠滿足PCR分析的需要。結(jié)果表明，3種方法均能有效地從麥芽糊精中獲得DNA，然而異硫氰酸胍法優(yōu)于SDS法和CTAB法。

麥芽糊精，DNA提取

麥芽糊精被廣泛應(yīng)用在糖果、麥乳精、果茶、奶粉、冰淇淋、飲料、罐頭及其他食品中，是各類食品的填充料和增稠劑。在健身食品中，它的主要作用是提供能量，使人快速增重［1］。由于麥芽糊精具有許多獨(dú)特的性狀特點(diǎn)，常常被作為乳品加工的主要填充增容材料，來提高牛乳的稠度和非脂固體的含量。一般來說，麥芽糊精的含量占奶粉比例的15%以下，雖然從一定程度來說對人體沒有明顯的害處，但是也會造成某些機(jī)能的缺失［2］。為了降低成本，其過量添加或違法添加均會相對地將乳粉中的蛋白質(zhì)、乳脂類、乳糖、礦物質(zhì)及各種維生素含量相應(yīng)大大減少，添加物過多也會破壞食物成分的營養(yǎng)平衡，不利于消費(fèi)者健康?，F(xiàn)階段對糊精的檢測除了傳統(tǒng)的生化方法［3－4］，食品安全工作者也期待能利用生物技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)對其精準(zhǔn)、快速的檢測。PCR、Southern雜交等方法常常被用于物種品種和食品摻假的鑒定，這些技術(shù)的前提是需要獲得高質(zhì)量的核酸。到目前為止，關(guān)于麥芽糊精中的基因組DNA提取方法還沒有報道。為此，本文以市售麥芽糊精為材料進(jìn)行麥芽糊精DNA提取方法的研究，旨在探索一種快速、簡便，能夠滿足PCR分析需要的麥芽糊精DNA提取方法，以期為今后利用生物技術(shù)方法進(jìn)行食品檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 3種方法提取的麥芽糊精DNA的純度和濃度

市售麥芽糊精(食品添加劑) 由齊齊哈爾大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供;異硫氰酸胍、十二烷基磺酸鈉(SDS)、CTAB、Triton－X 100、Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×PCR緩沖液(含Mg2+) 購自寶泰克生物科技有限公司;100bp ladder DNA marker 購自上海生工生物工程有限公司;CTAB抽提液組分 2%CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris HCl pH8.0;SDS抽提液組分 200mmol/L Tris－HCl(pH7.5)，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1%β－巰基乙醇;異硫氰酸胍裂解液組分5mol/L 異硫氰酸胍(GuSCN)，0.05mol/L Tris－HCl(pH6.4)，0.02mol/L EDTA(pH 8.0)，1.3%Triton X－100;TE緩沖液組分 10mmol/L Tris－鹽酸(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

臺式離心機(jī)、水浴鍋、紫外分光光度計、梯度PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀 均為本實(shí)驗室所有。

1.2 引物的合成

參照文獻(xiàn)［5］合成18SrDNA片段的引物;參照文獻(xiàn)［6－7］合成植物葉綠體rbcLDNA片段的引物;引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成(見表1)。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 DNA提取方法

1.3.1.1 CTAB法 參照文獻(xiàn)［8－9］并進(jìn)行修改，步驟:a.將50mg樣品加入600μL CTAB提取液中，65℃水浴30min，其間輕輕振蕩2～3次。b.加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，靜置 10min，12000r/min離心10min。c.將上清液轉(zhuǎn)至新管中，加入0.8倍體積的異丙醇，輕輕混勻，－20℃放置10～20min。12000r/min 離心10min。d.棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀，室溫晾干，加入30μL TE(pH8.0)溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 SDS法 參照文獻(xiàn)［10］并稍加改動，稱取50mg樣品置于1.5mL的離心管中，向管中加入600μL 65℃預(yù)熱的SDS提取液，65℃水浴30min。添加600μL的氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕振蕩，靜置10min，12000r/min離心10min，取上清，加入0.8倍體積的異丙醇，－20℃放置10～20min，12000r/min離心10min。DNA沉淀用70%乙醇洗滌，室溫晾干，加入30μL TE(pH8.0)溶解，－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 異硫氰酸胍法 參照文獻(xiàn)［11－13］并稍加修改。稱取50mg樣品置于1.5mL離心管中，加200μL TE溶液(pH8.0)，旋渦混勻。加入400μL裂解液，旋渦混勻，室溫靜置20min。加入600μL氯仿/異戊醇(體積比24∶1)，劇烈振蕩，12000r/min離心10min。取上清液，加0.8倍體積異丙醇，－20℃放置10～20min。12000r/min離心 10min。DNA沉淀用70%乙醇洗滌，室溫晾干，加入30μL TE(pH8.0)溶解，－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA純度和濃度檢測 吸取4μL DNA溶液，加入2mL蒸餾水，DNA母液被稀釋501倍。混勻，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中，用等體積的蒸餾水做空白對照。用紫外分光光度計測量260nm和280nm處的OD值，根據(jù)公式:DNA濃度=50×OD260×501(μg/μL)，計算 DNA 濃度;根據(jù) OD260/OD280判斷DNA的大致純度。

將采用三種方法提取的麥芽糊精DNA各取5μL，與1μL 6 × Loading Buffer混勻，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳(100V，30min)，結(jié)果用紫外凝膠成像儀觀察并拍照。

1.3.3 基因組DNA用于PCR擴(kuò)增的適應(yīng)性檢測基因組DNA樣品1μL做為模板，用18S核糖體RNA基因擴(kuò)增，用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體積為25μL。反應(yīng)程序均為:94℃預(yù)變性3.0min;94℃變性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸 30s，35 個循環(huán);72℃ 延伸5min。PCR產(chǎn)物用1.58%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的純度和濃度

從表2可以看出，異硫氰酸胍法和 SDS法的OD260/OD280基本在1.8～2.0之間，說明提取的DNA中RNA含量較少且沒有蛋白質(zhì)、酚污染;OD260/OD230均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2，表明三種方法提取的DNA均有鹽類、小分子污染，尤以異硫氰酸胍法污染嚴(yán)重。同時，采用異硫氰酸胍法提取的DNA的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CTAB法和SDS法。

2.2 基因組DNA的凝膠電泳檢測

由圖1可知，經(jīng)過四次重復(fù)實(shí)驗，用異硫氰酸胍法提取的麥芽糊精DNA譜帶單一，無DNA碎片和連片，說明此方法提取的DNA完整性好;四次重復(fù)實(shí)驗的DNA條帶遷移率一致，且重現(xiàn)性好，說明此方法具有較好的穩(wěn)定性。而在凝膠上看不到SDS法和CTAB法提取的基因組DNA譜帶，其可能原因一是這兩種方法提取的DNA濃度較低;二是沒有提取到DNA，所以觀察不到條帶。

2.3 基因組DNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)

麥芽糊精基因組DNA的PCR反應(yīng)結(jié)果見圖2和圖3。從二圖中可以看出，三種提取方法得到麥芽糊精基因組DNA樣品的PCR擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致。說明三種方法提取的麥芽糊精基因組DNA可以直接用于18SrDNA基因和植物葉綠體rbcLDNA片段的PCR擴(kuò)增。因此，可以認(rèn)為這三種方法均可提取到麥芽糊精基因組DNA，且滿足PCR擴(kuò)增實(shí)驗的要求。此結(jié)果也可以說明圖1的電泳結(jié)果中SDS法和CTAB法未出現(xiàn)譜帶的原因是DNA量太少，故EB染色后觀察不到條帶。

圖1 麥芽糊精基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2 18S rDNA片段的PCR產(chǎn)物

圖3 RBCL片段的PCR產(chǎn)物

3 討論

基因組DNA的提取質(zhì)量是影響分子生物學(xué)研究結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。麥芽糊精的原料是含淀粉質(zhì)的玉米、大米等，因此適用于植物基因組DNA的提取方法也可用于麥芽糊精基因組DNA的提取，例如CTAB法、SDS法和異硫氰酸胍法等。從光密度、瓊脂糖電泳和PCR的檢測結(jié)果來看，實(shí)驗采取異硫氰酸胍法所提取的麥芽糊精基因組DNA完整性好，濃度高，雖然小分子雜質(zhì)含量高，但不影響PCR擴(kuò)增實(shí)驗;CTAB法和SDS法提取的麥芽糊精基因組DNA雜質(zhì)含量較少，濃度雖然較低(甚至EB染色后看不到電泳的譜帶)，但是PCR擴(kuò)增實(shí)驗后亦有清晰的目的譜帶。結(jié)果說明，經(jīng)過DNA含量測定和電泳檢測比較，認(rèn)為異硫氰酸胍法更適合麥芽糊精基因組DNA的提取;相對于PCR擴(kuò)增實(shí)驗，三種提取基因組DNA的方法均是可行的。這三種方法均具有操作步驟少、實(shí)驗條件要求不高的特點(diǎn)。

本實(shí)驗以市售麥芽糊精為材料，在操作過程中需注意以下幾點(diǎn):a.樣品與抽提液要充分混勻，避免成團(tuán)結(jié)塊的現(xiàn)象出現(xiàn);b.麥芽糊精與CTAB抽提液或SDS抽提液混合后應(yīng)在65℃水浴中溫育30～60min，并多次進(jìn)行顛倒混勻，以完全破壞細(xì)胞膜，使DNA釋放到液相環(huán)境中，從而增加DNA得率。

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Comparison of different extraction methods of genomic DNA from malt dextrin

XU Wei－li1，LI Qi－ming2，WANG Jia－qi2，MA Ying1，*

(1.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China;2.Technique Center，New Hope Dairy Holdings Co.，Ltd，Chengdu 610023，China)

To find out a better one from three malt dextrin DNA extraction methods for the molecular marker analysis of high quality and sufficient samples.With malt dextrin purchased from the market as the tested material，the genomic DNA was extracted from malt dextrin using three different methods，such as CTAB method，SDS method and GuSCN method.The extraction effects of different methods were compared.The results of optical density detection showed that extraction amount and purity with GuSCN method were better than SDS method and CTAB method.The results of agarose gel electrophoresis determination showed that genome DNA band extracted by SDS method was clear and stable and genome DNA extracted by SDS method and CTAB method were not banded.The genomic DNA extracted with these methods all could be used in PCR reaction.The results showed that DNA could be obtained with three of all methods from malt dextrin，but the GuSCN method was the best extraction method.

malt dextrin;DNA extraction

Q789

A

1002－0306(2011)09－0217－03

2010－05－28 *通訊聯(lián)系人

徐偉麗(1977－)，女，博士，講師，從事食品生物技術(shù)和食品安全領(lǐng)域的研究。

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究(2009JY0101)。