鄒 建，劉亞偉

(1.河南商業(yè)高等專科學(xué)校，河南鄭州450045;2.河南工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，河南鄭州450001)

酶法制備辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的工藝及其優(yōu)化

鄒 建1，劉亞偉2

(1.河南商業(yè)高等專科學(xué)校，河南鄭州450045;2.河南工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，河南鄭州450001)

以玉米淀粉為原料，用α－淀粉酶對(duì)合成的辛烯基琥珀酸酐淀粉水解，研究酶法制備辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的工藝條件，并通過響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化。確定合成的最佳工藝參數(shù)為:酶用量115U/g，水解溫度95℃，水解時(shí)間49min，所得產(chǎn)品辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值為8.01。通過響應(yīng)面方差分析可以得出，三個(gè)因素對(duì)辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值的影響顯著，且加酶量與水解溫度、水解溫度與水解時(shí)間之間的交互影響作用也顯著。

辛烯基琥珀酸酐水解淀粉，α－淀粉酶，響應(yīng)面分析

辛烯基琥珀酸酐水解淀粉是將原淀粉進(jìn)行辛烯基琥珀酸酐(OSA)酯化，再水解成不同程度的雙重改性淀粉［1］。這種產(chǎn)品具有酯化和水解兩種改性淀粉的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于水包油的乳液中可大大提高乳液的乳化性和增稠性，其抗老化性和穩(wěn)定性與辛烯基琥珀酸酐淀粉相比也有了很大地提高［2］。目前，國內(nèi)外對(duì)辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的研究主要集中在用酸水解制備該復(fù)合改性淀粉并對(duì)其性質(zhì)和反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究，但是，以玉米淀粉為原料，采用α－淀粉酶水解制備辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的研究較少。本論文以玉米淀粉為原料，首先合成辛烯基琥珀酸酐酯化淀粉(DS=0.019)，然后采用α－淀粉酶對(duì)其進(jìn)行水解，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了酶解條件，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化，以期獲得酶解的最佳條件，確定不同水解因素對(duì)合成該復(fù)合改性淀粉的交互影響作用，為進(jìn)一步工業(yè)合成穩(wěn)定的辛烯基琥珀酸酐水解玉米淀粉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 市售;辛烯基琥珀酸酐 武漢馳飛化工有限公司;耐高溫α－淀粉酶 配制的500mL酶液，其活力為27663U/mL，湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司。

PHS－25B型數(shù)字酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司;JJ－1型定時(shí)電動(dòng)攪拌器 金壇市華峰儀器有限公司;DZKW－C型電子恒溫水浴鍋 北京光明醫(yī)療器械廠;78HW－1恒溫磁力攪拌器 金壇市華峰儀器有限公司;SYO智能玻璃缸恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限公司;SB233268烏氏粘度計(jì) 北京科思佳公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的制備

1.2.1.1 玉米淀粉的酯化 準(zhǔn)確稱量一定質(zhì)量的淀粉，溶解在去離子水中，配制成35%的淀粉溶液，用電動(dòng)攪拌器不停的攪拌，并將反應(yīng)容器放入一定溫度的恒溫水浴中。用2%的氫氧化鈉把淀粉溶液的pH控制在8.0～8.5，取一定量的OSA(辛烯基琥珀酸酐)加入到淀粉溶液中，反應(yīng)一定的時(shí)間后，用5%的鹽酸溶液將淀粉溶液的pH調(diào)整為6.5，濃漿抽濾，烘干，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 辛烯基琥珀酸酐淀粉的酶解 取一定量的辛烯基琥珀酸酐淀粉配制成35%濃度的淀粉溶液，將pH調(diào)節(jié)到6.0～6.5，放入恒溫水浴中使淀粉徹底糊化，然后加入一定量的耐高溫液化酶，恒溫反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)過程中不斷用攪拌器攪拌，反應(yīng)結(jié)束后用HCl溶液將反應(yīng)溶液pH調(diào)節(jié)至6.5。靜置一段時(shí)間后，用不同濃度的乙醇溶液洗滌沉淀產(chǎn)品，直至將產(chǎn)品中的水全部洗出為止，在干燥箱中過夜干燥。

1.2.2 測定指標(biāo)

1.2.2.1 淀粉水分含量測定 淀粉水分含量的測定:按GB12087－89方法測定。

1.2.2.2 辛烯基琥珀酸酐淀粉取代度(DS)的測定［3］

稱取1.5g(干基)樣品置于100mL燒杯中。加入50mL 95%乙醇，在磁力攪拌器上攪拌10min，加15mL 2mol/L鹽酸的乙醇溶液酸化30min。將樣品倒入布氏漏斗中，用90%的乙醇抽濾洗滌至無Cl－(硝酸銀溶液檢驗(yàn))。再將樣品轉(zhuǎn)移入250mL的三角瓶中，加入100mL的蒸餾水，沸水浴中加熱20min，在溶液中滴加兩滴酚酞試劑，趁熱用0.1mol/L的NaOH滴定至粉紅色。同時(shí)制備不加入酸酐的樣品為空白。

注:A:每克淀粉所消耗的0.1mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mmol。

式中:V－滴定待測樣品所消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL;M－氫氧化鈉溶液的摩爾濃度，mol/L;m－待測樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2.3 辛烯基琥珀酸酐水解淀粉葡萄糖當(dāng)量(DE值)的測定［4］采用直接滴定法進(jìn)行測定，用還原糖量間接反映DE值的高低。

1.2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝實(shí)驗(yàn) 在水解單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析軟件(design expert6.0)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化酶解工藝條件。

1.2.2.5 水解單因素實(shí)驗(yàn)方法 以實(shí)驗(yàn)室合成的辛烯基琥珀酸酐淀粉(DS=0.019)為原料，在耐高溫淀粉酶的最佳pH范圍為6.2～6.5下進(jìn)行反應(yīng)，分別選擇加酶量(U/g)、水解溫度(℃)、水解時(shí)間(min)三個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，其中:水解溫度對(duì)DE值的影響單因素實(shí)驗(yàn)條件為:α－淀粉酶用量90U/g、水解時(shí)間30min;α－淀粉酶用量對(duì)DE值的影響單因素實(shí)驗(yàn)條件為:水解溫度92℃、水解時(shí)間30min;水解時(shí)間對(duì)DE值的影響單因素實(shí)驗(yàn)條件為:水解溫度92℃、α－淀粉酶用量90U/g。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

耐高溫淀粉酶的最佳pH范圍為6.2～6.5，分別選擇加酶量(U/g)、水解溫度(℃)、水解時(shí)間(min)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:

2.1.1 水解溫度對(duì)DE值的影響 從圖1可以看出，在水解時(shí)間和加酶量一定的情況下，隨著水解溫度的升高，水解DE值逐漸升高。分析原因?yàn)?，淀粉在水解過程中先要吸水膨脹，體積迅速增加，晶體結(jié)構(gòu)破壞，顆粒外膜裂開，形成一種糊狀的粘稠液體即淀粉的糊化。淀粉經(jīng)過糊化作用后，雖然原有的淀粉鏈還未真正打開，但是由于外膜已經(jīng)裂開，晶體結(jié)構(gòu)受到破壞，淀粉分子就直接暴露在酶分子的作用之下，分子鏈即迅速斷開、變短，糊液粘度降低，形成低分子糊精溶液［5］。同時(shí)，隨著水解溫度的升高，一方面耐高溫淀粉酶的活性提高，活力增加，使得其對(duì)淀粉的水解程度提高，另一方面由于溫度的升高，淀粉糊化更加徹底，這樣有助于淀粉酶的水解作用，因此復(fù)合改性淀粉的DE值逐漸升高。

圖1 水解溫度對(duì)DE值的影響

2.1.2 α－淀粉酶用量對(duì)DE值的影響 從圖2可以看出，在水解時(shí)間和水解溫度一定的情況下，增加淀粉酶的量可以提高淀粉的水解程度。原因是隨著淀粉酶用量的增加，酶作用于淀粉的幾率也相應(yīng)的增加，使得淀粉水解程度提高。但當(dāng)?shù)矸勖赣昧砍掷m(xù)增大時(shí)，反應(yīng)效率會(huì)隨之下降，復(fù)合改性淀粉的DE值增大趨勢變緩。

圖2 α－淀粉酶用量對(duì)DE值的影響

2.1.3 水解時(shí)間對(duì)DE值的影響 從圖3可以看出，在淀粉酶用量和水解溫度一定的情況下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，水解DE值逐漸升高，從30min到60min時(shí)增加的較為明顯，60min后再延長時(shí)間DE值增加的趨勢不是很明顯。這是因?yàn)棣粒矸勖甘且环N內(nèi)切酶，隨機(jī)的水解α－1，4－糖苷鍵，不能水解支叉部位的α－1，6－糖苷鍵，但是可以越過此鍵，繼續(xù)水解α－1，4－糖苷鍵，由于淀粉中其自身的 α－1，6－糖苷鍵和底物的酯鍵二者的雙重作用，影響了酶的水解速度［6］，即使延長了反應(yīng)時(shí)間，水解DE值升高也不明顯。因此，要想獲得高DE值的產(chǎn)品，水解時(shí)間不宜過長。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝條件

圖3 水解時(shí)間對(duì)DE值的影響

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析軟件，選取α－淀粉酶用量、水解溫度、水解時(shí)間作為三個(gè)因素，因素水平表如表1所示，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及測定結(jié)果

根據(jù)表中的實(shí)驗(yàn)組合以及所測得DE值，利用響應(yīng)面分析軟件，可以得出三個(gè)因素與DE值之間得回歸關(guān)系式:

方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

從響應(yīng)面方差分析表中可以看出，在水解響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)中加酶量與水解溫度、水解溫度與水解時(shí)間之間的交互影響作用明顯，具體分析原因如下。

2.2.1 加酶量和水解溫度之間的交互作用 由圖4可以看出，在同一溫度下，隨著加酶量的增加，水解的DE值是逐漸升高的，這是因?yàn)樵黾用傅挠昧亢?，反?yīng)體系中的酶增加，它作用于淀粉分子的機(jī)會(huì)就相應(yīng)的增加了，用量越多水解的程度越大，造成DE值升高［7］。

圖4 加酶量和水解溫度之間的交互作用

從圖4還可以發(fā)現(xiàn)酶用量增加后，DE值在高溫下增加的趨勢明顯高于低溫，在同一酶用量的情況下，隨溫度的升高，DE值逐漸升高，說明溫度對(duì)水解反應(yīng)是一個(gè)重要的因素。原因?yàn)?α－淀粉酶是內(nèi)切酶，隨溫度的升高，淀粉鏈的活動(dòng)性增加，有利于酶對(duì)淀粉鏈的進(jìn)攻［8］，隨著溫度的升高，淀粉溶解度增加，底物淀粉的濃度增加，酶活力的穩(wěn)定性增強(qiáng)，水解率增加。

2.2.2 水解溫度和水解時(shí)間的交互作用 由圖5可以看出，水解時(shí)間一定時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，水解DE值逐漸升高。當(dāng)溫度一定時(shí)，隨著水解反應(yīng)時(shí)間的延長，水解DE值也是逐漸升高的，原因之前單因素實(shí)驗(yàn)分析已經(jīng)論述。

圖5 水解溫度和水解時(shí)間的交互作用

由圖5還可知，溫度較低時(shí)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，水解DE值增加的很明顯，但在高溫下，水解DE值增加的卻不是很明顯。說明α－淀粉酶的水解反應(yīng)適合高溫短時(shí)下進(jìn)行反應(yīng)，也可以在低溫長時(shí)下反應(yīng)［9］。

2.3 合成辛烯基琥珀酸酐水解淀粉最佳工藝條件

以制取DE值為8的辛烯基琥珀酸酐水解淀粉為例，響應(yīng)面給出十個(gè)最佳工藝條件(表3)，可以從中選取合適的條件來制備。

最佳工藝條件的驗(yàn)證:選取上述10個(gè)最佳條件中的任意四個(gè)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

因此可以選擇10號(hào)為最佳條件，修正后為:酶用量115U/g，水解溫度95℃，水解時(shí)間49min，所得辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值為8.01。

表4 水解最佳條件驗(yàn)證

表3 實(shí)驗(yàn)最佳條件方案表

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的工藝參數(shù)，以α－淀粉酶用量、水解溫度、水解時(shí)間作為三個(gè)因素，采用Central composite design設(shè)計(jì)和Design 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定最佳的工藝參數(shù)為:酶用量115U/g，水解溫度95℃，水解時(shí)間49min，所得產(chǎn)品辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值為8.01。通過響應(yīng)面方差分析可以得出，三個(gè)因素對(duì)辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值的影響顯著，且加酶量與水解溫度、水解溫度與水解時(shí)間之間的交互影響作用也顯著。

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Optimization condition of octenyl succinic anhydride hydrolysis starch by enzymolysis

ZOU Jian1，LIU Ya－wei2

(1.Henan Business College ，Zhengzhou 450045，China;2.Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China)

The synthesis process condition of enzymatic octenyl succinic anhydride(OSA)corn starch was researched.Through hydrolysis response surface analysis，the results showed that the optimum condition of synthesizing enzymatic OSA corn starch(DE=8.01)was enzyme dosage 115U/g，hydrolysis temperature 95℃，hydrolysis time 49 minutes;enzyme dosage and hydrolysis temperature，hydrolysis temperature and hydrolysis time interacted significantly;DE value increased significantly higher in high temperature than in low temperature.

enzymatic octenyl succinic anhydride hydrolysis starch;α－amylase;response surface analysis

TS231

A

1002－0306(2011)09－0174－04

2011－04－18

鄒建(1981－)，講師，在職博士，研究方向:食品添加劑及傳統(tǒng)食品工業(yè)化研究。