劉書(shū)來(lái)，鄭蔚然，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014)

壇紫菜R-藻紅蛋白的穩(wěn)定性研究

劉書(shū)來(lái)，鄭蔚然，丁玉庭*

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014)

為了揭示壇紫菜R－藻紅蛋白(R－PR)的環(huán)境穩(wěn)定性變化規(guī)律，分別研究了不同光照強(qiáng)度、溫度、pH和金屬離子條件下壇紫菜R－藻紅蛋白光譜特性的影響。研究結(jié)果表明:壇紫菜R－藻紅蛋白在40℃以下、弱光(2000lux以內(nèi))及pH5.0～8.0條件下相對(duì)穩(wěn)定，光譜特性基本無(wú)變化;其中4℃、pH7.0的避光條件下R－PE尤為穩(wěn)定;高溫、紫外線、酸堿環(huán)境均影響壇紫菜R－PE穩(wěn)定性，導(dǎo)致在565nm和498nm處特征吸收峰發(fā)生顯著減弱并逐漸消失。壇紫菜R－藻紅蛋白的兩種藻膽色素的熱穩(wěn)定性關(guān)系為:藻尿膽素＞藻紅膽素。此外，F(xiàn)e2+、Fe3+、Cu2+對(duì)壇紫菜R－PE的穩(wěn)定性的破壞作用顯著，而Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對(duì)其穩(wěn)定性影響較小。

R－藻紅蛋白，穩(wěn)定性，壇紫菜，光譜特性

藻紅蛋白(R－phycoerythrin，R－PE)具有色澤鮮艷和強(qiáng)熒光的特性，能夠取代合成色素廣泛應(yīng)用于食品和化妝品，因此具有良好的市場(chǎng)前景［1］。由于R－PE易受溫度、光照和酸堿度等環(huán)境因素影響，極大地限制了其開(kāi)發(fā)利用;目前已有學(xué)者進(jìn)行了紅毛藻 R－PE［2］、紫球藻 B－PE［3］、螺旋藻 C－PC(藻藍(lán)蛋白，phycocyanin)［4］等藻膽蛋白的研究，但對(duì)壇紫菜R－PE的研究較少。我國(guó)壇紫菜資源十分豐富，可大量用于R－PE制備原料。本研究將利用壇紫菜提取制備R－PE，以A565和A498吸收光譜表征指標(biāo)考察溫度、光照、pH和金屬離子對(duì)壇紫菜R－PE吸收光譜特性的影響，同時(shí)對(duì)其變性機(jī)理進(jìn)行討論，為壇紫菜藻紅蛋白的提取分離、貯藏、開(kāi)發(fā)利用提供很好的理論和應(yīng)用指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

壇紫菜(Porphyra haitanensis) 采集于溫州洞頭，經(jīng)蒸餾水浸泡清洗三次，冷凍干燥，并在冷卻條件下粉碎成60目于－20℃避光保存。

Alpha2－4 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST公司;CR21GⅡ高速冷凍離心機(jī)日本HITACH公司;UV－2450紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)日本SHIMADU公司;pHS－3C精密pH計(jì) 上海雷磁分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 壇紫菜R－PE的分離純化 稱取壇紫菜干粉以1∶20(w/v)懸浮于 0.01mol/L K2HPO4－KH2PO4緩沖液(pH7.0)，在－20℃與4℃溫度下反復(fù)凍融三次，離心(10000×g，4℃)20min，收集上清液。在該上清液中加入(NH4)2SO4進(jìn)行分步鹽析，得到的紫紅色沉淀即為藻紅蛋白(R－PE)。將沉淀的R－PE重新溶于適量的上述磷酸鹽緩沖溶液中，并置于該緩沖液中透析24h(每隔 4h更換一次緩沖液)，離心(10000×g，4℃)10min。將離心后的上清液上樣倒羥基磷灰石柱，用0.01～0.10mol/L磷酸鉀緩沖液(含0.10mol/L NaCl，pH7.0)進(jìn)行梯度洗脫，通過(guò)測(cè)定各管洗脫液吸收光譜的變化鑒別其R－PE的純度。收集含R－PE的洗脫液經(jīng)超濾脫鹽后，再上樣到DEAE Sepharose F.F.層析柱，以 0.1～0.4mol/L NaCl溶液(pH7.0，含0.01mol/L磷酸鉀緩沖液)洗脫，對(duì)洗脫液進(jìn)行光譜掃描，鑒定其R－PE純度較高的部分，脫鹽，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 壇紫菜R－PE熱穩(wěn)定性的研究 用0.01mol/L K2HPO4－KH2PO4緩沖液(pH7.0)稀釋同一濃度(A565為0.2～0.8)R－PE 溶液，分別在 4、28、40、50、70、80℃下避光恒溫放置1h后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 壇紫菜R－PE光穩(wěn)定性的研究 用上述磷酸鹽緩沖液稀釋的同一濃度(A565為0.2～0.8)R－PE溶液，分別置于避光環(huán)境、陽(yáng)光照射(均105lux)、室內(nèi)自然光(均800lux)、日光燈光(均2000lux)及15W紫外燈光下5h后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 壇紫菜R－PE pH穩(wěn)定性的研究 分別用檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0、4.0、5.0、6.0)、磷酸鈉緩沖液(pH7.0、8.0)、甘氨酸－NaOH 緩沖液(pH9.0、10.0)、碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖液(pH11.0)、氯化鉀－氫氧化鉀緩沖液(pH12.0)稀釋至A565為0.2～0.8的同一濃度R－PE溶液，4℃下避光放置0.5h后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 金屬離子對(duì)壇紫菜R－PE影響的研究 在壇紫菜R－PE溶液中加入金屬鹽類并稀釋至A565為0.2～0.8的同一濃度，金屬離子終濃度分別為 2g/L CaCl2、0.6g/L MgCl2、12mg/L ZnSO4、30mg/L FeSO4、45mg/L FeCl3、1mg/L CuSO4、0.50mg/L MnCl2，于 4℃下避光放置1h后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 吸收光譜測(cè)定 將壇紫菜R－PE的待測(cè)樣品避光放置至室溫后，進(jìn)行紫外－可見(jiàn)光吸收光譜測(cè)定，掃描范圍為250～700nm，中速掃描，間隔1.0nm，狹縫寬2.0nm，比較考察A565和A498。

2 結(jié)果與討論

2.1 壇紫菜R－PE的吸收光譜特性

以砂為骨料、石膏為主要的膠結(jié)材料，水泥為輔助膠結(jié)材料，1%硼砂溶液作為緩凝劑。按照一定的配比號(hào) 573 進(jìn)行試驗(yàn)，配比情況為膠結(jié)材料與砂的比為5∶1，水泥、石膏比為7∶3。在本試驗(yàn)中，取骨料的質(zhì)量為1 700 g，按照相似材料配比方案計(jì)算，需要水泥 238 g，石膏 102 g，硼砂溶液 340 g。

壇紫菜R－PE溶液呈粉紅色且?guī)в袩晒?，其吸收光譜如圖1所示。圖譜顯示，壇紫菜R－PE在565nm和498nm處出現(xiàn)最大吸收峰，分別為其色基的特征吸收:藻紅膽素(phycoerythrobilin，PEB，λmax=565nm)和藻尿膽素(phycourobilin，PUB，λmax=498nm);540nm處有一吸收肩峰，應(yīng)為雙峰型R－PE，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［5］。

溶液中的R－PE含量可用A565表示，且其純度通常以 A565/A280表示［1，6］。本研究中分離純化得到的壇紫菜R－PE，其濃度為0.6g/L，純度為1.2，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)食品級(jí)要求，因此有望作為天然著色劑應(yīng)用于食品中。

2.2 壇紫菜R－PE的熱穩(wěn)定性

由圖2可知，40℃以下，壇紫菜R－PE吸收光譜特性和吸光值的變化不明顯;50～70℃，壇紫菜R－PE在565nm處的特征吸收峰下降變化明顯，而498nm處的特征吸收相對(duì)穩(wěn)定，由此表明藻膽色素的熱穩(wěn)定性PUB＞PEB;80℃以上時(shí)，壇紫菜R－PE的A565和A498由初始狀態(tài)時(shí)的0.637、0.395分別下降至0.261和0.339，且特征吸收峰消失。

圖1 壇紫菜R－PE的紫外可見(jiàn)吸收光譜

此外，近紫外區(qū)的吸收強(qiáng)度A隨著溫度升高而增大，這是因?yàn)樵迥懙鞍鬃冃允蛊渖庹褂诖蟓h(huán)螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，增大了其在近紫外段的吸光值。

色素蛋白的變性引起結(jié)構(gòu)解離變化將直接影響吸收光譜特性及吸光值。通常用AVIS/AUV的大小表示藻膽蛋白色基構(gòu)象的變化，天然態(tài)時(shí)AVIS/AUV＞4，變性時(shí)比值小于 1［7－8］。本研究結(jié)果表明:隨著溫度的升高，壇紫菜R－PE吸收光譜特性及吸光值存在明顯的差異性，甚至導(dǎo)致特征吸收峰逐漸衰弱并消失，這可能是其分子內(nèi)部或分子間，由于熱能破壞了維護(hù)色基的藻紅膽素和藻尿膽素與亞基結(jié)合的鍵能的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)所致［3］。

圖2 溫度對(duì)壇紫菜R－PE光譜特性的影響

2.3 壇紫菜R－PE的光穩(wěn)定性

光照對(duì)壇紫菜R－PE穩(wěn)定性的影響如圖3所示。結(jié)果表明，在避光、室內(nèi)自然光和日光燈下，壇紫菜R－PE的吸收光譜特征和吸光值的變化不明顯;而紫外光和太陽(yáng)光對(duì)壇紫菜R－PE穩(wěn)定性影響顯著，565nm和498nm特征吸收強(qiáng)度均發(fā)生顯著下降，特別是紫外光照射后的A565值下降了71.73%，A498值下降了57.55%，這可能是紫外光引起壇紫菜R－PE的色基PEB和PUB降解或構(gòu)象破壞使其摩爾吸光系數(shù)發(fā)生變化所致［2－3］。

圖3 光對(duì)壇紫菜R－PE光譜特性的影響

2.4 壇紫菜R－PE的pH穩(wěn)定性

由圖4可知，壇紫菜R－PE在pH5.0～8.0內(nèi)較穩(wěn)定，其吸收光譜特征和吸光值差異不明顯，尤以pH7.0時(shí)最穩(wěn)定;同樣PEB較穩(wěn)定的pH為5.0～8.0，PUB為pH5.0～9.0。而在pH3.0和4.0時(shí)，R－PE溶液變成淺紫色，并產(chǎn)生紫色沉淀，其A565值分別下降了50.35%和23.85%，A498值則分別下降了38.28%和26.56%;當(dāng)pH＞9.0時(shí)，R－PE溶液變成橙色，pH為11.0時(shí)，溶液顏色褪色、熒光淬滅，pH為12.0后，溶液幾乎完全褪色，A565值和A498值均顯著下降，分別由0.717和0.418下降至0.104和0.198，同時(shí)特征吸收峰消失，且產(chǎn)生一定紅移。壇紫菜R－PE在酸性環(huán)境內(nèi)容易產(chǎn)生沉淀，這可能是該環(huán)境較接近其等電點(diǎn)所致;而在堿性環(huán)境內(nèi)吸光度大幅度下降，可能是其結(jié)構(gòu)易發(fā)生解離所致。

圖4 pH對(duì)壇紫菜R－PE光譜特性的影響

2.5 金屬離子對(duì)R－PE光譜特性的影響

Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+等金屬離子對(duì)壇紫菜R－PE的影響如圖5所示。結(jié)果表明，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對(duì)壇紫菜 R－PE 穩(wěn)定性的影響不顯著，565nm和498nm時(shí)的特征吸收峰變化也不明顯。而Cu2+、Fe2+對(duì)藻膽色素在近紫外區(qū)的影響較大，壇紫菜R－PE溶液中加入Fe3+后即刻產(chǎn)生紫紅色絮狀沉淀析出而逐漸變成無(wú)色;加入Cu2+后即刻成為紫色渾濁液。同時(shí)從Cu2+影響的光譜中發(fā)現(xiàn)，PEB的吸收峰下降明顯，而PUB的吸收峰變化不明顯。這可能是其引起R－PE結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致摩爾吸光系數(shù)的改變。Fe2+和Fe3+差異性之大有待進(jìn)一步研究。

圖5 金屬離子對(duì)壇紫菜R－PE光譜特性的影響

3 結(jié)論

壇紫菜 R－PE適宜在 40℃以下、可見(jiàn)光強(qiáng)2000lux以內(nèi)及 pH5.0～8.0條件下加工;其中4℃、pH7.0的避光條件為保存壇紫菜R－藻紅蛋白的最佳條件;不宜添加 Fe2+、Fe3+、Cu2+等營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對(duì)其穩(wěn)定性影響較小。兩種藻膽色素的熱穩(wěn)定性關(guān)系為:藻尿膽素＞藻紅膽素。本研究結(jié)果可以為壇紫菜R－PE作為食品添加劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

［1］Galland－Irmouli A V，Ponsa L，Lucon M，et al.One－step purification of R－phycoerythrin from the red macroalga Palmaria palmata using preparative polyacrylamide gel electrophoresis［J］.Journal of Chromatography B，2000，739:117－123.

［2］鄭江，高亞輝，王文星，等.紅毛藻藻紅蛋白的粗提方法比較及不同光照條件下藻膽蛋白變性機(jī)制的初步探討［J］.廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2003，42(1):117－122.

［3］胡金梅，魏東，郭祀遠(yuǎn)等.環(huán)境因子和變性劑作用下B－藻紅蛋白的光譜與熒光光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2006，26(12):2258－2263.

［4］張熙穎，劉魯寧，陳秀蘭，等.鈍頂螺旋藻藻膽體的穩(wěn)定性研究［J］.海洋科學(xué)，2004，28(8):38－42，46.

［5］何培民.海藻生物技術(shù)及其應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007，199－206.

［6］Niu J F，Wang G C，Tseng C K.Method for large－ scale isolation and purification of R－phycoerythrin from red algaPolysiphoniaurceolataGrev［J］ .Protein Expression and purification，2006，49:23－31.

［7］畢海，張光明，王偉.紫外輻照對(duì)鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白的影響研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26(3):1033－1039.

［8］王廣策，鄧田，曾呈奎.藻膽蛋白的研究概況(Ⅱ)——藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)及其光譜特性［J］.海洋科學(xué)，2000，24(3):19－22.

Study on the stability of R－phycoerythrin from Porphyra haitanensis

LIU Shu－lai，ZHENG Wei－ran，DING Yu－ting*

(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang of University Technology，Hangzhou 310014，China)

Effects of environmental factors such as heat，light，pH and some metal ions of nutrition fortifiers on specific absorption spectrum characteristics of R－phycoerythrin(R－PE)from Porphyra haitanensis were systematically investigated in this paper.The specific absorption spectrum of R－PE was relatively stable when it was stored at 4～0℃，pH5.0～8.0 and faint light(below 2000 lux).The optimum storage conditions for R－PE was 4℃，pH7.0 and in completely dark.High temperature，extreme pH and ultraviolet ray greatly affected the specific absorption spectrum of R－PE and led to declining of the specific absorption peaks or even disappearance.Thermo stability of R－PE was as follows:PUB ＞PEB.The addition of Fe2+，F(xiàn)e3+and Cu2+had significantly denatured effects on R－PE，while Ca2+，Mg2+，Zn2+and Mn2+had no apparent effect on the specific absorption spectrum of R－PE.

R－phycoerythrin;stability;Porphyra haitanensis;specific absorption spectrum

TS255.1

A

1002－0306(2011)09－0120－03

2010－09－01 *通訊聯(lián)系人

劉書(shū)來(lái)(1977－)，男，博士，副教授，研究方向:海洋資源開(kāi)發(fā)與利用。

國(guó)家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2007AA091801)。