劉百祥，邵志清

(1.華東理工大學(xué)物理系，上海 200237;2.華東理工大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與工程系，上海 200237)

隨著人類對(duì)基因技術(shù)的研究日益深入，基因檢測(cè)在衛(wèi)生防疫、醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的需求不斷增大，基因檢測(cè)的方法也越來越多。在眾多的DNA檢測(cè)技術(shù)中，DNA電化學(xué)傳感器做為一種新的檢測(cè)手段，與傳統(tǒng)診斷技術(shù)相比，它以簡(jiǎn)單、快速、靈敏、廉價(jià)的方式獲得大量序列特異性信息［1－3］，尤其是它的分子識(shí)別功能，在基因診斷、治療和傳染性疾病檢測(cè)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

電化學(xué)DNA傳感器通常是通過電極表面連接電化學(xué)指示劑標(biāo)記的ssDNA來識(shí)別與之互補(bǔ)的目標(biāo)DNA序列，電化學(xué)指示劑是一類具有電化學(xué)活性的物質(zhì)，通常使用二茂鐵衍生物，還有鄰苯二胺、陽離子金屬復(fù)合物有機(jī)染料等。但它們往往同時(shí)與ssDNA和dsDNA 結(jié)合，選擇性不理想［4－5］。亞甲基藍(lán)(MB)是具有芳香雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，它可以選擇性地識(shí)別單、雙鏈DNA，而且單、雙鏈DNA電極的響應(yīng)電流差別較大，是比較理想的電化學(xué)指示劑［6－8］。

圖1 亞甲基藍(lán)的分子結(jié)構(gòu)

化學(xué)氣相沉積法生成的金剛石薄膜電極作為一種良好的生物傳感器基底電極，它以摻硼金剛石(Boron-Doped Diamond BDD)薄膜作為電極材料，而摻硼金剛石薄膜特殊的sp3鍵結(jié)構(gòu)及其具有的導(dǎo)電性，賦予了金剛石薄膜電極優(yōu)異的電化學(xué)特性［9－11］，如寬的電化學(xué)勢(shì)窗、較低的背景電流、較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性以及較強(qiáng)的抗污染特性等，因此我們選用BDD做為本實(shí)驗(yàn)的工作電極。

制備電化學(xué)DNA傳感器最重要的步驟就是探針DNA在基體電極上的固定，而對(duì)于惰性的金剛石電極來說就更是挑戰(zhàn)。有關(guān)金剛石電極表面電化學(xué)處理及光化學(xué)處理連接探針DNA均有報(bào)道。Nebel等［12］將金剛石電極通過苯基重鹽處理還原使之連接氨基基團(tuán)，進(jìn)而連接DNA;Hamers等［13］應(yīng)用光化學(xué)的方法在金剛石電極共價(jià)連接氨基。雖然這種共價(jià)鍵和的方法固定的DNA相對(duì)穩(wěn)定，但是過程復(fù)雜，制備時(shí)間較長(zhǎng)，限制了它的應(yīng)用。

二氧化鋯特殊的分子結(jié)構(gòu)使得其對(duì)含氧基團(tuán)的分子(比如磷酸基)具有良好的生物親合力，曾有氧化鋯修飾的玻碳電極、碳納米管電極、金電極、納米金電極和碳糊電極上制備DNA電化學(xué)傳感器的報(bào)道［14－18］，我們?cè)谠囼?yàn)中設(shè)計(jì)了一種非常簡(jiǎn)單、方便的固定探針DNA的方法，首先在摻硼金剛石薄膜電極表面電化學(xué)聚合一層氧化鋯薄膜，將5'末端修飾磷酸基團(tuán)的寡核苷酸短鏈(ssDNA)連接到氧化鋯薄膜上。以亞甲基藍(lán)(MB)為氧化還原的電子媒介體，應(yīng)用循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖法(DPV)測(cè)試了該電極的性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

CHI 900 B電化學(xué)工作站(美國)，AutoLab電化學(xué)工作站(荷蘭)，工作電極為摻硼金剛石電極，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為銀/氯化銀電極。

1.2 試劑

氧氯化鋯(ZrOCl2·8H2O)購自the Aldrich Chemical Co.，TE 緩沖液(pH 8)含 10 mmol Tris-HCl and 1 mmol EDTA，PBS緩沖液(pH 7.4)做為支持電解質(zhì)(137 mmol NaCl，2.7 mmol KCl，10 mmol Na2HPO4，1.76 mmol KH2PO4)，所有其它試劑購自Sigma-Aldrich公司，所有溶液應(yīng)用二次純水(Millipore system)。

探針DNA(ssDNA)5'-PO4-GAG CGG CGC AAC ATT TCA GGT CGA-3'，靶向 DNA 5'-TCG ACC TGA AAT GTT GCG CCG CTC-3'，非靶向 DNA 5'-GAG CGG CGC AAC ATT TCA GGT CGA TGG ACT AAC AGG TTA TTC GAA-3'。購自Integrated DNA Technologies(IDT，Leuven Belgium)。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1 金剛石電極處理

摻硼金剛石電極在使用前依次用0.3 μm、0.05 μm的A12O3粉末拋光成鏡面(鋁粉打磨設(shè)備購自Bioanalytical Systems)。拋光后電極用蒸餾水沖洗三次、然后用蒸餾水超聲清洗6 min，再進(jìn)行電化學(xué)清洗過程:在傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)應(yīng)用循環(huán)伏安法在0.1 mol/L硝酸溶液中處理20個(gè)循環(huán)(掃描電壓2.4 V～－1.7 V vs.Ag/AgCl)，蒸餾水沖洗干凈后備用。

1.3.2 電化學(xué)沉積二氧化鋯

以處理好的金剛石電極為工作電極，銀－氯化銀電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，將此三電極系統(tǒng)置于5 mmol/L ZrOCl2水溶液中，支持電解質(zhì)為0.1 mol/L KC1，在－1.1 V ～0.7 V 范圍內(nèi)以 20 mV/s循環(huán)伏安掃描，即得ZrO2/BDD電極。

1.3.3 DNA 的固定與雜交

將 ZrO2/BDD 電極浸入含 2.15×10－7mol/L ssDNA探針的2.0 mL Tris.HC1緩沖溶液中，于室溫吸附1 h，取出后用超純水清洗以除去未固定的ssDNA，得到ssDNA/ZrO2/BDD電極。將此電極置于含2.15×10－7mol/L 互補(bǔ)目標(biāo) DNA(cDNA)的雜交液中，室溫雜交30 min，取出后PBS溶液沖洗，再用超純水清洗以除去未雜交的 cDNA，即得雙鏈 DNA(dsDNA)修飾電極，記為dsDNA/ZrO2/BDD電極。

電化學(xué)測(cè)量:以各修飾電極為工作電極，在1.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1 ∶1，V/V)的0.1 mol/L KC1溶液中，于CHI 900B工作站上記錄其循環(huán)伏安曲線及差分脈沖曲線，實(shí)驗(yàn)在室溫條件下進(jìn)行，檢測(cè)溶液為含1.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1，V/V)的0.1 mol/L KC1 溶液。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

在本次試驗(yàn)中選用表面光滑的摻硼金剛石電極，按照文獻(xiàn)［19］介紹的方法經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)后確定如下電化學(xué)參數(shù):應(yīng)用循環(huán)伏安法在5 mmol ZrOCl2(含0.1 mol KCl支持電解質(zhì))－1.1 V ～0.7 V 間電化學(xué)沉積40個(gè)循環(huán)，掃描速率20 mV/s。結(jié)果如圖2所示。由于二氧化鋯是惰性的，隨著電化學(xué)掃描的進(jìn)行，還原電流的峰值不斷減小，逐漸趨于穩(wěn)定，電極表面形成超薄的多孔膜。完成全部掃描后電化學(xué)測(cè)試電極的大部分活性依然保留。

圖2 電化學(xué)沉積氧化鋯的循環(huán)伏安曲線

根據(jù)前面介紹的DNA的固定與雜交步驟，制得的DNA電化學(xué)傳感器選擇性能測(cè)試，通過探針DNA修飾的摻硼金剛石電極經(jīng)與靶向DNA和非靶向DNA雜交后，再應(yīng)用循環(huán)伏安法和差分脈沖法進(jìn)行表征得到結(jié)果如圖3。

圖3 (a)probe-DNA/ZrO2/BDD電極；(b)ncDNA/

由圖3可見，ss-DNA/ZrO2/BDD電極的還原峰電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ds-DNA/ZrO2/BDD電極的還原峰電流，這是因?yàn)閜robe-DNA的自由鳥嘌呤與亞甲基藍(lán)的較強(qiáng)的結(jié)合力使得s-DNA/ZrO2/BDD電極表面積累的亞甲基藍(lán)比較多，則還原峰電流較大。而DNA雜交后，自由鳥嘌呤大大減少，導(dǎo)致亞甲基藍(lán)的峰電流亦隨之降低。而與非靶向DNA雜交后電極的響應(yīng)電流與ss-DNA/ZrO2/BDD電極的還原峰電流大小相近。表明電極選擇性良好。

圖4為差分脈沖法測(cè)得的電極雜交前后的響應(yīng)曲線，結(jié)果與循環(huán)伏安方法得到的一致。所以，本試驗(yàn)方法制備的DNA電化學(xué)傳感器選擇性好，可顯著識(shí)別特異的DNA序列。測(cè)試結(jié)果也證明了氧化鋯薄膜修飾的電極表面由于氧化鋯的特殊的分子結(jié)構(gòu)可以用來固定帶有磷酸基的探針DNA。

圖4 差分脈沖法測(cè)得的工作電極雜交前后的響應(yīng)曲線

圖5所示為不同工作電極差分脈沖曲線，同樣可見亞甲基藍(lán)的峰電流隨著靶向DNA的濃度增加而顯著減少，通過測(cè)得不同靶向DNA濃度所對(duì)應(yīng)的峰電流值，得到線性方程:

平行測(cè)定空白溶液11次的標(biāo)準(zhǔn)偏差為σ，根據(jù)3σ法計(jì)算此DNA電化學(xué)生物傳感器以DPV法測(cè)得其檢出限為7.55×10－12mol/L。

圖5 不同濃度

圖6 亞甲基藍(lán)峰電流值與靶向DNA濃度的對(duì)數(shù)值關(guān)系圖

3 結(jié)論

通過電化學(xué)方法沉積氧化鋯多孔膜到摻硼金剛石電極表面，成功地將探針寡核苷酸短鏈固定至氧化鋯分子上制成DNA電化學(xué)傳感器，制作方法簡(jiǎn)單、方便。以亞甲基藍(lán)為氧化還原指示劑測(cè)定了傳感器的性能。由于硼摻雜的金剛石電極抗污染、背景電流非常小，而DNA與氧化鋯的連接穩(wěn)定，使得制備的電化學(xué)傳感器表現(xiàn)出良好的選擇性，電極線性范圍寬，穩(wěn)定性好。

［1］Charels D，Broeders S，Corbisier P，et al.Emons H Toward Metrological Traceability for DNA Fragment Ratios in GM Quantification.3.Suitability of DNA Calibrants Studied with a MON 810 Corn Model［J］.Agric Food Chem 2007，55(9):3268－3274.

［2］杜曉燕，陳文華，電化學(xué)DNA傳感器及其在環(huán)境和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用［J］.傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2002，15(4):347－352.

［3］Benoit V，Steel A，Torres M，et al.Evaluation of Three-Dimensional Microchannel Glass Biochips for Multiplexed Nucleic Acid Fluorescence Hybridization Assays［J］.Anal.Chem.2001，73(11)，2412－2420.

［4］Barton J K.Metals and DNA:Molecular Left-Handed Complements［J］.Science，1986，233(4765)，727－734.

［5］Kumar C V，Barton J K，Turro N J.Photophysics of Ruthenium Complexes Bound to Double Helical DNA［J］.J.Am.Chem.Soc.，1985，107(19)，5518－5523.

［6］Erdem A，Kerman K，Meric B，et al.Methylene Blue as a Novel Electrochemical Hybridization Indicator［J］.Electroanal，2001，13(3):219－223.

［7］李建平，費(fèi)棟.負(fù)載亞甲基藍(lán)的納米磁性碳粉修飾電極研制及DNA 的測(cè)定［J］.傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，20(9):1940－1944.

［8］Zhu N N，Zhang A P，Wang Q J，et al.Electrochemical Detection of DNA Hybridization Using Methylene Blue and Electro-Deposited Zirconia Thin Films on Gold Electrodes［J］.Anal.Chim.Acta，2004，510(2):163－168.

［9］Christoph E Nebel，Bohuslav Rezek，Dongchan Shin，et al.Diamond for Bio-Sensor Applications［J］.J.Phys.D:Appl.Phys.，2007，40(20):6443－6466.

［10］John S Foord，Jingping Hu，Katherine B Holt.Diamond Ultramicroelectrodes［J］.Phys.Stat.Sol.(a)，2007，204(9):2940－2944.

［11］Jingping Hu，Katherine B Holt，John S Foord.Focused Ion Beam Fabrication of Boron-Doped Diamond Ultramicroelectrodes［J］.A-nal.Chem.，2009，81(14)，5663－5670.

［12］Shin D，Tokuda N，Rezek B，et al.Periodically Arranged Benzene-Linker Molecules on Boron-Doped Single-Crystalline Diamond Films for DNA Sensing［J］.Electrochem.Commun.，2006，8(5):844－850.

［13］Yang Wensha，Auciello Orlando，Butler James E，et al.DNA-Modified Nanocrystalline Diamond Thin-Films as Stable，Biologically Active Substrates［J］.Nature Materials，2002，1(4)，253－257.

［14］Piconi C，Maccauro G.Zirconia as a ceramic biomaterial［J］.Biomaterials，1999，20(1):1－25.

［15］Buscher C T，McBranch D，Li D.Understanding the Relationship between Surface Coverage and Molecular Orientation in Polar Self-Assembled Monolayers［J］.J.Am.Chem.Soc.，1996，118(12):2950－2953.

［16］Liu S Q，Xu J J，Chen H Y.A Reversible Adsorption-Desorption Interface of DNA Based on Nano-Sized Zirconia and Its Application，Coll.Surf.B 36，2004，155－159.

［17］Zuo Shao-hua，Zhang Ling-fan，Yuan Hui-hui，et al.Electroche-mical Detection of DNA Hybridization by Using a Zirconia Modified Renewable Carbon［J］.Paste Electrode Bioelectrochemistry，2009，74:223－226.

［18］Wei Zhang，Tao Yang，Chen Jiang，et al.DNA Hybridization and Phosphinothricin Acetyltransferase Gene Sequence Detection Based on Zirconia/Nanogold Film Modified Electrode［J］.Applied Surface Science，2008，254(15):4750－4756.

［19］Baixiang Liu，Jingping Hu，John s Foord.Electrochemical Deposition of Zirconia Films on Diamond，Electrochemical and Solid-State Letters［J］.2011，14(2):D20－D22.