周向東，陳惠濱，詹舒越，王曉萍* ，歐惠超，羅昭鋒

(1.浙江大學現(xiàn)代光學儀器國家重點實驗室，杭州 310027；2.集美大學信息工程學院，福建 廈門 361021；3.中國科技大學合肥微尺度國家實驗室，合肥 230027)

由于環(huán)境污染導致的海水富營養(yǎng)化以及赤潮，會破壞海洋的正常生態(tài)結(jié)構(gòu)。赤潮導致海洋生物死亡產(chǎn)生毒素，并污染海洋中養(yǎng)殖的蝦、貝類等，通過食物鏈的傳遞，造成人類食物中毒［1］。

目前海洋赤潮毒素的檢測方法主要有生物分析法、化學儀器分析法和免疫檢測法。以小鼠實驗為典型的生物分析法［2］，雖然簡單易行，但因生物個體差異，導致測量結(jié)果偏差大，且靈敏度非常低，特異性差。高效液相色譜法［3－4］可以準確分離各種組分，實現(xiàn)海洋藻毒素定性和定量分析，但是大多數(shù)毒素如PSP(Paralytic Shellfish Poisoning，)、DSP(Diarrhetic Shellfish Poisoning，腹瀉性貝類毒素)等必須經(jīng)熒光衍生后才能檢測，衍生后的熒光產(chǎn)物均很不穩(wěn)定，容易造成測量偏差。因此國內(nèi)外逐步將色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［5］應(yīng)用于多種海洋生物毒素的分析，但色譜分析法因為儀器昂貴，需要專業(yè)操作人員等原因限制了方法的普及和應(yīng)用。利用多克隆或單克隆抗體檢測的酶聯(lián)免疫分析法［6－8］具有高特異性和選擇性，分析過程無需繁瑣的樣品前處理步驟，具有商品化的試劑盒為該方法的進一步廣泛應(yīng)用提供了可能性。但其檢測過程需要酶標記抗體及依賴于酶催化反應(yīng)的比色檢測，導致成本增加，耗時長達數(shù)小時，且檢測過程仍需依賴實驗室環(huán)境，難以適應(yīng)現(xiàn)場分析檢測的實時性要求。

本文以在我國渤海、長江口、福建沿海、珠江口、香港和臺灣等海域廣泛分布［9］的腹瀉性貝類毒素中的大田軟海綿酸(Okadaic Acid，OA)為分析檢測對象，將免疫分析方法與表面等離子共振檢測技術(shù)相結(jié)合，建立一種免標記、響應(yīng)速度快、靈敏度高、低成本的可以應(yīng)用于海洋赤潮毒素分析的快速SPR免疫檢測分析方法。提出并設(shè)計了一種小型化、可適用于現(xiàn)場應(yīng)用的SPR免疫檢測分析系統(tǒng)，制備了可識別OA的特異性免疫傳感芯片，通過實驗分析并評價了該檢測系統(tǒng)的性能指標。

1 檢測原理與實驗裝置

表面等離子共振是光在玻璃與金屬薄膜界面發(fā)生全反射時產(chǎn)生的倏逝波引發(fā)金屬表面的自由電子產(chǎn)生表面等離子(Surface Plasmon，SP)，并在表面等離子與倏逝波頻率和波數(shù)相同的情況下產(chǎn)生的一種共振現(xiàn)象，由此導致反射光的能量急劇下降，反射光譜上出現(xiàn)共振峰。當傳感芯片表面固定一層生物分子識別膜，將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子相互作用的分子，會引起金膜表面折射率變化，最終導致SPR共振峰變化，從而可獲得被分析物的濃度、親和力、動力學常數(shù)和特異性等信息［10］。

自行研制開發(fā)的表面等離子共振免疫檢測分析系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。傳感器選用Kretschmann結(jié)構(gòu)的TSPR1A170100 SpreetaTM傳感器，其折射率分辨率為5×10－6RIU，具有體積小、功耗低、性價比高等特點；十通閥(美國Valco Inc.)用于切換選擇緩沖液、待檢樣品和再生液等；工業(yè)注射泵(Sapphire EngineeringTMInc.)依據(jù)程序?qū)⒏鞣N溶液注射流經(jīng)表面功能化的SPR傳感器表面，傳感器輸出的SPR光譜經(jīng)信號檢測與控制電路采集后，傳送到計算機進行分析處理。在軟件的控制下，系統(tǒng)可實現(xiàn)自動進樣、測量、再生、清洗等功能。

2 材料與方法

2.1 材料

NHS(N－h(huán)ydroxysuccinimide，N－羥基琥珀酰亞胺)；EDC(1－ethyl－3－(3－dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，水溶性碳化二亞胺)；TeCP(tetrachlophenoxide，四氯苯酚)；鹽酸乙醇胺(1 mol/L ethanolamine hydrochloride，pH=8.5，Alfa Aesar Inc.):純度＞98%；SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)溶液:質(zhì)量分數(shù)為10%；OA-mAb(OA單克隆抗體，清華大學生命科學學院)；OA標準品(Sigma Inc.):純度＞95%；OA-BSA(OA牛血清蛋白偶聯(lián)物溶液，Sigma Inc.)；PBS(phosphate buffered saline，磷酸鹽緩沖液):將8.0 g NaCl、2.9 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4、0.2 g KCl溶于800 mL蒸餾水中，調(diào)整溶液pH值至7.4，補充液體使溶液體積為1 L，分裝、高壓蒸汽滅菌后室溫保存；再生液:100 mmol/L的NaOH溶液與質(zhì)量分數(shù)為0.05%的SDS溶液混合。

2.2 測試方法及生物芯片制備

由于OA是小分子，為提高檢測靈敏度通常采用間接檢測法即抑制法進行測量。其過程為:將OA抗原偶聯(lián)在SPR傳感器芯片(金膜)表面；將適量的OA-mAb與含有OA分子的被測溶液混合，抗原抗體結(jié)合達到平衡態(tài)，此時混合液有一定量多余的OA-mAb；將該混合液作為SPR儀器的被測樣品注入并流經(jīng)傳感器金膜表面，此時混合液中多余的OA-mAb與修飾在傳感器金膜表面的OA抗原結(jié)合，SPR輸出信號發(fā)生變化，根據(jù)SPR輸出信號的大小，可以得到混合液中多余OA-mAb的量，從而可以計算出被測溶液中的OA分子濃度。

為使SPR傳感器對特定待測分子具有特異性，需要對傳感器芯片(金膜)表面進行修飾。對于OA傳感芯片的制備，是利用OA-BSA偶聯(lián)物的巰基與傳感器金膜表面共價偶聯(lián)，形成一層自組裝的單分子檢測層。具體的步驟如下:

①用H2SO4∶H2O2(98%濃硫酸∶30%雙氧水=7∶3)清洗傳感器金膜表面12 h。

②取OA-BSA溶液20 μL滴于芯片表面反應(yīng)8 h，使OA-BSA通過巰基固定于芯片表面。

③回收芯片表面的OA-BSA溶液，沖洗芯片表面，氮氣吹干，2 mg/mL BSA+1%TeCP 溶液 20 μL滴于芯片表面，反應(yīng)5 h。在TeCP作用下，BSA的蛋白二硫鍵被打開，封閉未吸附OA-BSA的金膜表面，以減少結(jié)合過程的非特異性吸附。

④沖洗芯片表面，氮氣吹干。NHS/EDC混合溶液20 μL滴于芯片表面反應(yīng)5 h，交聯(lián)活化芯片，使得芯片表面的獨立蛋白BSA之間的羧基與氨基交聯(lián)在一起，提高結(jié)合的穩(wěn)定性。

⑤沖洗芯片表面，氮氣吹干。鹽酸乙醇胺20 μL滴于芯片表面反應(yīng)12 h，封閉芯片表面多余的羧基，減少羧基對抗體蛋白的非特異性吸附。

2.3 測試過程

2.3.1 測試條件優(yōu)化

分別以100 mmol/L NaOH與100 mmol/L NaOH+0.05%SDS混合溶液為再生液，以稀釋200倍的OA-mAb溶液作為檢測樣品，25 μL/min速度進樣，進樣量50 μL，考察芯片再生后，基線的恢復能力。

將OA 單克隆抗體用 PBS 按 1 ∶100、1 ∶200、1∶300比例稀釋后，分別作為檢測樣品，以25 μL/min速度進樣，進樣量50 μL，測試三種不同稀釋比抗體溶液的SPR響應(yīng)值，選擇合理的稀釋倍數(shù)。

2.3.2 檢測方法性能測試

以 1 ∶200 OA-mAb 溶液為測試樣品，25 μL/min速度進樣，每次進樣50 μL并再生，連續(xù)進樣12次，測試芯片穩(wěn)定性。

用PBS緩沖液、OA標準品和1∶200 OA-mAb溶液，配制出 OA 含量分別為 2.5、5、10、20、40、80、160、320、640、1280 ng/mL OA 的混合溶液，由高濃度到低濃度依次檢測，每個濃度重復3次，獲取OA標準曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 測試條件選定

抗體稀釋200倍，兩種不同再生液條件下的SPR譜圖如圖 2、圖 3所示，分別以 100 mmol/L NaOH、100 mmol/L NaOH+0.05%SDS 混合溶液為再生液，SPR結(jié)合前與恢復后的基線并不對齊，存在大約48RU、77RU的結(jié)合量差值，表明所選擇的再生液并不能使傳感器表面的抗原和抗體結(jié)合物完全分離。而由100 mmol/L NaOH+0.05%SDS混合溶液、100 mmol/L NaOH兩種再生溶液先后再生兩次可以使基線回復到起始水平，如圖1所示，因此設(shè)定再生條件先由100 mmol/L NaOH+0.05%SDS混合溶液再生，后由100 mmol/L NaOH再次再生一次。

圖2 抗體稀釋200倍，再生液為NaOH的SPR譜圖

圖3 抗體稀釋200倍，再生液為NaOH+SDS的SPR譜圖

OA-mAb稀釋100、200、300倍的SPR譜圖如圖4所示，由圖可見，在相同的進樣速度和進樣量條件下，抗體稀釋100倍的溶液結(jié)合量最大，達135RU；而抗體稀釋300倍的溶液結(jié)合量最小，僅為80RU。雖然抗體稀釋100倍溶液結(jié)合值較大，但抑制濃度隨之增大，最終導致檢測限變大，且抗體消耗量也大，會增加分析成本；而抗體稀釋300倍的溶液結(jié)合值低，競爭抑制曲線動態(tài)響應(yīng)范圍小，會導致定量濃度范圍變窄。因此選擇抗體稀釋200倍較為恰當，其響應(yīng)值為123RU，能在檢測限、樣品消耗量及信號動態(tài)響應(yīng)范圍之間取得一個合理的平衡。

圖4 單次完整的測量過程，

3.2 穩(wěn)定性

分析重復性實驗的12次測量結(jié)果，求得12次響應(yīng)信號的均值約為123.6RU，標準偏差為2.34RU，RSD值為1.51%，響應(yīng)信號的最大偏差在8RU之內(nèi)。結(jié)果表明傳感器芯片表面偶聯(lián)的抗原結(jié)合牢固，抗體稀釋倍數(shù)和再生條件選擇合理。在該條件下，測試方法具有良好的重復性。

3.3 抑制標準曲線

分析不同濃度OA溶液的SPR測量結(jié)果，以SPR傳感器的響應(yīng)結(jié)合值為縱坐標，OA濃度值的對數(shù)為橫坐標，得到OA標準曲線如圖5所示。結(jié)合值最低和最高濃度端分別由于飽和結(jié)合及抑制溶液中抗體濃度低而趨向于平穩(wěn)，中間部分呈線性遞減的過程，很好的符合抑制模式的抗原抗體生物測量過程。用Sigmoidal非線性關(guān)系擬合，得方程Y=A2+(A1－A2)/(1+(x/x0)p)，A1=113.0，A2=33.3，x0=182.7，p=2.4，擬合曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.993。

圖5 OA的標準曲線

FDA的《標準分析方法與步驟依據(jù)指南》［11］中定義的檢測限為DL=3.3σ/S，其中σ為重復性測量的標準偏差，S為標準曲線的斜率。由標準曲線測量點可得S=0.398RU·mL/ng，σ=2.34RU，進而可以計算出該方法的檢測限為19.4 ng/mL，半抑制濃度 IC50(Half-maximal Inhibitory Concentration)為177 ng/mL。由標準曲線及檢測限可確定其定量范圍為40 ng/mL～640 ng/mL。

由圖4可知，一次完整的SPR檢測過程包括結(jié)合、解離、再生及恢復四個過程，耗時約為15 min左右。在實際應(yīng)用過程種，根據(jù)單次測量的響應(yīng)值，由標準曲線可得到相應(yīng)的OA濃度值。相比化學儀器分析法及酶聯(lián)免疫法，其快速定量過程是一大優(yōu)勢，可滿足現(xiàn)場實時檢測的需求。

4 結(jié)論與展望

本文結(jié)合表面等離子共振技術(shù)與免疫檢測技術(shù)，以大田軟海綿酸為例，以點帶面，研究和建立了一種新型赤潮毒素的檢測方法。并基于所設(shè)計的表面等離子免疫檢測分析系統(tǒng)，分析評價了該方法的主要性能指標。研究表明，所建立的檢測方法，可以滿足國際上對于海水赤潮災(zāi)害毒素警戒標準的檢測要求。所采用免疫檢測技術(shù)具有特異性，可直接分析海水中OA，省去了大量繁瑣的樣品前處理過程，縮短了樣品分析時間(單次樣品的分析時間僅為15 min)；所設(shè)計的傳感器經(jīng)再生后可重復使用上百次，且無需任何標記即可實現(xiàn)OA實時檢測，從而大大節(jié)省分析測試的成本。實驗結(jié)果表明，該系統(tǒng)實現(xiàn)OA檢測的檢測限未能明顯優(yōu)于其他的檢測方法。但通過樣品富集［12］或抗體信號增強［13］等方法可以大大改善系統(tǒng)的檢測限，且所研究建立的新方法很好地克服了傳統(tǒng)分析方法操作繁瑣，檢測時間長，成本高或需要標記等不足。因此，本文建立的新方法為海水水質(zhì)的在線分析檢測提供了新的選擇方案。

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