李小穎，董 偉，張連峰

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.國(guó)家中醫(yī)藥局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型3級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

熒光素酶標(biāo)記人胃癌細(xì)胞裸鼠原位移植模型的建立

李小穎1，董 偉1，張連峰2

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.國(guó)家中醫(yī)藥局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型3級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 建立熒光素酶標(biāo)記人胃癌原位異種移植模型。方法 將螢火蟲(chóng)熒光素酶作為標(biāo)記基因?qū)肴宋赴㎝GC803細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞，將其接種裸鼠胃壁漿膜下，建立胃癌裸鼠原位腫瘤模型。用活體熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并進(jìn)行小動(dòng)物超聲影像和病理學(xué)分析。結(jié)果 裸鼠原位成瘤率為100%，活體熒光成像觀察發(fā)現(xiàn)在接種第7天，就可以觀察到腫瘤發(fā)光。21 d后腫瘤進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，28 d后腫瘤出現(xiàn)明顯壞死，平均熒光光子數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。超聲成像發(fā)現(xiàn)小鼠胃部有直徑為8.39 mm，面積為28.92 mm2瘤塊。結(jié)論熒光素酶標(biāo)記可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)原位異種移植人胃癌生長(zhǎng)狀況。

人胃癌細(xì)胞;腫瘤模型;熒光素酶;生物發(fā)光;小動(dòng)物超聲

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)其 發(fā)病率居各類(lèi)腫瘤的首位，胃癌可發(fā)生于任何年齡，每年約17萬(wàn)人死于胃癌。理想的胃癌裸小鼠人類(lèi)腫瘤動(dòng)物模型是研究腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移生物學(xué)以及尋求抗癌新藥和新方法的重要工具。人胃癌裸鼠原位移植模型自1993年 Furukawa等［1］首次報(bào)道建立后，逐漸被應(yīng)用于胃癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗胃癌轉(zhuǎn)移藥物的研究。但傳統(tǒng)的動(dòng)物模型由于缺乏理想的細(xì)胞標(biāo)記，不易實(shí)時(shí)記錄腫瘤生長(zhǎng)情況及評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物治療效果［1-3］。生物發(fā)光成像技術(shù)是利用底物熒光素在熒光素酶(luciferase，Luc)標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞中，能夠被穩(wěn)定表達(dá)的熒光素酶催化而發(fā)光，在活體動(dòng)物水平觀察腫瘤變化情況的一種新技術(shù)，廣泛用于腫瘤生長(zhǎng)的示蹤和治療效果的評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)利用螢火蟲(chóng)熒光素酶基因標(biāo)記人胃癌細(xì)胞MGC803，并建立表達(dá)熒光素酶的人胃癌裸鼠原位移植模型，利用生物發(fā)光成像技術(shù)對(duì)此模型內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行非侵入性的連續(xù)監(jiān)測(cè)，以便建立便于即時(shí)監(jiān)測(cè)胃癌生長(zhǎng)和藥物治療效果評(píng)價(jià)的生物發(fā)光模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：人胃癌細(xì)胞MGC803凍存于本實(shí)驗(yàn)室，L-谷氨酰胺、雙抗、DMEM、胎牛血清(Gibco公司)、G418(Amresco公司)、脂質(zhì)體 2000(Invitrogen公司)?；铙w熒光影像系統(tǒng)(I.C.E.，日本 Roper公司)、倒置顯微鏡(Nikon TS100)。Vevo770TM小動(dòng)物超聲探測(cè)系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/cA-nu裸小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［XCXK(京)2007-0001］，鼠齡5周，體重15～18 g，在本實(shí)驗(yàn)室無(wú)特定病原體(specific-pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間(SYXK(京)2009-0003)飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為GC-09-2001)。1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基作為MGC803細(xì)胞的培養(yǎng)液，于5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建帶有篩選標(biāo)記的載體：pCAGGS-Neo-Luc由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［4］。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選：采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞(具體轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體2000操作說(shuō)明)。轉(zhuǎn)染后24 h，用含1 000 μg/mL G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞，直至形成肉眼可見(jiàn)的單克隆，挑取單克隆于96孔板，于5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，匯合度達(dá)70% ～90%后，傳代(1：2傳代)，取其中一塊96孔板加入用DMEM配置的底物luciferin(1 mg/mL)20 μL，放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像15 min，Slide Book 4.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 裸鼠胃癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察：收集處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，稀釋至2×106cells/mL。取250 μL細(xì)胞懸液接種于已禁食24 h的裸鼠胃壁漿膜下，并可見(jiàn)漿膜下鼓起一透亮小泡為標(biāo)志，共接種3只。分別在接種的7、14、21、28和35 d觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。觀察前每只裸鼠腹腔注射熒光素底物(1.5 mg/10 g)，飽和三溴乙醇(0.18 mL/10 g)麻醉后放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像，Slide Book 4.0軟件進(jìn)行分析。以腫瘤細(xì)胞發(fā)射的光子數(shù)對(duì)小鼠荷瘤時(shí)間作圖，得到熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.5 超聲圖像采集：腫瘤長(zhǎng)到第五周時(shí)，用三溴乙醇注射麻醉后(0.18 mL/10 g體重)，置于檢測(cè)臺(tái)上，將臺(tái)溫設(shè)定為40℃，小鼠四肢用醫(yī)用膠布固定于涂有導(dǎo)電膠的電極上，記錄生理指標(biāo)。用VisualSonics? Vevo770?操作系統(tǒng)和專(zhuān)門(mén)用于小鼠的RMV704高頻超聲探頭，進(jìn)行 B型檢測(cè)。通過(guò)VisualSonics?Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定高表達(dá)Luc的單克隆細(xì)胞株

獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的細(xì)胞克隆(圖1箭頭所示)，經(jīng)過(guò)多次傳代表達(dá)水平穩(wěn)定，標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)方式、生長(zhǎng)速度等與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)明顯差異。

2.2 Luc標(biāo)記MGC803小鼠胃癌原位腫瘤模型的動(dòng)態(tài)觀察

從圖2可見(jiàn)腫瘤接種第7天，就可以觀察到腫瘤發(fā)光，隨著觀察天數(shù)的增加，發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)。圖3發(fā)現(xiàn)腫瘤接種21 d后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，28 d后腫瘤的發(fā)光強(qiáng)度逐漸減弱，推測(cè)腫瘤出現(xiàn)了壞死。

2.3 小動(dòng)物超聲影像學(xué)和病理學(xué)觀察

腫瘤接種35 d后，超聲成像發(fā)現(xiàn)小鼠胃部有直徑為8.39 mm，面積為28.92 mm2瘤塊(圖4A)。脫頸處死小鼠并解剖，暴露胃部，發(fā)現(xiàn)胃上有灰白色的腫瘤組織，表面呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)地較硬(圖4B)，(圖1，2，4 見(jiàn)封三)。

3 討論

原位胃癌腫瘤模型已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)研究中顯示出其優(yōu)勢(shì)，尤其移植模型的方法改進(jìn)已經(jīng)使其成為聯(lián)系實(shí)驗(yàn)和臨床的工具。1993年，F(xiàn)urukawa等［1］首次報(bào)道將組織學(xué)完整的瘤組織縫掛于裸鼠胃壁，建立人胃癌原位移植模型，該模型能動(dòng)態(tài)反映胃癌從原位生長(zhǎng)、局部浸潤(rùn)到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)展過(guò)程，是研究胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移特點(diǎn)的良好模型。1997年，汪芳裕等［2］首次采用荷包縫合的方法，在裸鼠胃壁縫制粘膜小囊包埋腫瘤組織，建立原位腫瘤移植模型，克服了組織縫掛法的瘤組織早期未與胃壁粘膜接觸的缺點(diǎn)。2005年，陳亞琳等［3］將手術(shù)方法經(jīng)適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，采用OB膠粘貼法將完整的瘤組織粘貼于裸鼠胃壁，建立人胃癌原位移植模型，該模型取代了胃囊法，既有胃囊法的優(yōu)點(diǎn)，又操作相對(duì)簡(jiǎn)便，對(duì)裸鼠的創(chuàng)傷小。近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要集中于上述三種移植模型的方法研究［5-8］。但是由于腫瘤組織在體內(nèi)不便監(jiān)測(cè)，不能對(duì)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，需要在不同時(shí)間點(diǎn)犧牲小鼠、解剖、染色、病理分析等實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)利用螢火蟲(chóng)熒光素酶基因標(biāo)記人胃癌細(xì)胞MGC803，使胃癌細(xì)胞成為發(fā)光源，然后將其原位接種裸鼠胃壁漿膜下，用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)在接種的第7天，就可以觀察到腫瘤發(fā)光，21 d后腫瘤進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，28 d后腫瘤的發(fā)光強(qiáng)度減弱，推測(cè)腫瘤出現(xiàn)了壞死。腫瘤接種35 d后，超聲成像發(fā)現(xiàn)小鼠胃部有直徑為8.39 mm，面積為28.92 mm2瘤塊。另外解剖學(xué)觀察，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的可行性。此模型克服了以往胃癌模型不宜動(dòng)態(tài)觀察的不足，應(yīng)用該模型能夠更準(zhǔn)確地反映腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)際情況，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量大為減少，有效排除了動(dòng)物個(gè)體間差異的影響，可對(duì)癌癥治療之前和過(guò)程中的癌細(xì)胞變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估，熒光素酶標(biāo)記的人胃癌原位轉(zhuǎn)移模型是研究胃癌原位轉(zhuǎn)移簡(jiǎn)便可行的新方法。

［1］ Furukawa T，F(xiàn)u XY，Kubota T，et al.Nude mouse metastatic models of human stomach cancer constructed using orthotopic implantation of histologically intact tissue ［J］.Cancer Res，1993，53：1204-1208.

［2］ 汪芳裕，朱人敏，王琳，等.建立裸小鼠人胃癌原位移植模型的一種新方法［J］. 金陵醫(yī)院學(xué)報(bào)，2007，10(2)：238-240.

［3］ 陳亞琳，魏品康，許玲，等.采用 OB膠粘貼法建立人胃癌裸鼠原位種植轉(zhuǎn)移模型［J］. 癌癥，2005，24(2)：246-248.

［4］ 李小穎，高凱，董偉，等.熒光素酶標(biāo)的人肝癌細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發(fā)光成像和 PET-CT成像比較［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，21(3)：10-13.

［5］ 楊波，脫帥，脫朝偉，等.原位移植體內(nèi)連續(xù)篩選法建立人胃惡性淋巴瘤裸小鼠高轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90(6)：413-417.

［6］ Shi J，Wei PK，Zhang S，et al.OB glue paste technique for establishing nude mouse human gastric cancer orthotopic transplantation models ［J］.World J Gastroenterol，2008，14(30)：4800-4804.

［7 ］ Cui JH，Kruger U，Vogel l，et al.Intact tissue of gastrointestinal cancer specimen orthotopically transplanted into nude mice［J］.Hepatogastroenterology，1998，45(24)：2087-2096.

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Establishment of a Human Gastric Cancer Orthotopic Transplantation Model Labeled with Luciferase

LI Xiao-ying1，DONG Wei1，ZHANG Lian-feng1，2
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China;2.Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021)

Objective To establish a human gastric cancer orthotopic xenograft model labeled with luciferase.Methods Luciferase labeled MGC803 cells were cloned with G418 selection(MGC803-Luc).MGC803-Luc cells were implanted into the stomach wall of BALB/cA-nu mice to establish the tumor-bearing mouse models.Whole-body optical imaging technique was used to monitor the growth of the implanted tumor.Results The successful rate of orthotopic transplantation was 100%.The whole-body optical imaging found that the fluorescence could be detected at 7 days after transplantation.The tumor growth became logarithmic after 21 days.However，the mean fluorescent intensity tended to decline when the tumor had apparent necrosis after 28 days.Ultrasonic imaging found a tumor on the stomach，approximately 8.39 mm in diameter and 28.92 mm2in area.Conclusions It is possible to real-time monitoring the growth of human gastric cancer labeled with luciferase in animals.

Human gastric carcinoma;Tumor model;Luciferase;Bioluminescent imaging;Small-animal ultrasound

R33

A

1671-7856(2011)04-0028-03

2010-10-09

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.007

衛(wèi)生部項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)疾病動(dòng)物模型資源擴(kuò)展(200802036)和十一五新藥專(zhuān)項(xiàng)支持(2009ZX09501-026)。

李小穎(1981-)，女，實(shí)習(xí)研究員。E-mail：lixiaoyinghebei@163.com。

張連峰，E-mail：zhanglf@cnilas.org。