李 悅，莎日娜，許 璇，喬文濤，邵一鳴，楊貴波

(1.南開大學(xué)艾滋病研究中心，天津 300071;2.天津市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，天津 300222;3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病與艾滋病中心，北京 102211)

攜帶GFP發(fā)光基因人猴嵌合免疫缺陷病毒SHIV的構(gòu)建及活性檢測(cè)

李 悅1，莎日娜2，許 璇1，喬文濤1，邵一鳴3，楊貴波3

(1.南開大學(xué)艾滋病研究中心，天津 300071;2.天津市醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，天津 300222;3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病與艾滋病中心，北京 102211)

目的 獲得正常感染宿主細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的SHIV毒株，為后期建立發(fā)光SHIV/恒河猴感染模型奠定基礎(chǔ)。方法 通過分子克隆手段，將綠色熒光蛋白基因克隆到攜帶HIV-1包膜蛋白的SHIV病毒全基因組中，并在細(xì)胞水平檢測(cè)各毒株的感染活性及熒光蛋白表達(dá)能力。結(jié)果 得到一株可表達(dá)綠色熒光蛋白的病毒株SHIV-KB9nefGFP，并具有感染TZM-bl細(xì)胞系及猴PBMC的能力。結(jié)論 該毒株在宿主細(xì)胞恒河猴PBMC中具有一定復(fù)制能力，希望通過后續(xù)的猴體內(nèi)傳代實(shí)驗(yàn)獲得毒力更強(qiáng)的發(fā)光病毒。

HIV-1;SHIV;模型，動(dòng)物;GFP熒光蛋白;感染活性

SHIV(simian/human immunodeficiency virus)，即SIV/HIV嵌合病毒，是一種通過基因重組技術(shù)置換SIV和HIV的相應(yīng)基因而構(gòu)建出來的人造病毒，由于攜帶HIV-1結(jié)構(gòu)基因而表現(xiàn)出人類病毒的部分特征，同時(shí)能夠有效的感染恒河猴［1-7］。因此，SHIV/恒河猴模型是目前評(píng)價(jià)抗艾滋藥物和疫苗的常規(guī)動(dòng)物模型，也為HIV-1致病機(jī)制的研究提供了平臺(tái)［8，9］。

判斷病毒感染機(jī)體水平的高低，需要病毒載量(viral load，VL)的檢測(cè)［10，11］。數(shù)據(jù)顯示機(jī)體感染早期，體內(nèi)病毒的復(fù)制水平可以決定宿主的疾病進(jìn)程［12］。因此初期感染時(shí)，機(jī)體中病毒侵入的組織類型及擴(kuò)散程度對(duì)后期疾病進(jìn)程的理解及治療具有重要指導(dǎo)意義，而常規(guī)的檢測(cè)手段無法達(dá)到需要的效果。最初，使用原位雜交(in situ hybridization，ISH)和免疫組化(immunohistochemistry，IHC)的方法對(duì)病毒感染后各種組織的感染情況進(jìn)行分析［13，14］。然而，這些手段的靈敏度和特異性具有一定的局限且實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，不能很好的對(duì)體內(nèi)病毒感染情況實(shí)時(shí)定位和定量。我們考慮利用顏色標(biāo)記物使病毒自身可以發(fā)光，進(jìn)而對(duì)被感染的細(xì)胞或機(jī)體中病毒復(fù)制情況進(jìn)行精確監(jiān)測(cè)。

源于水母(Aequorea victoria)等海洋無脊椎動(dòng)物的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一種很好的標(biāo)記物。其內(nèi)源熒光基團(tuán)在紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)可高效發(fā)射清淅可見的綠光，且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，與其它標(biāo)記物相比具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)［15］。本研究將綠色熒光蛋白基因插入攜帶HIV-1包膜蛋白的SHIV-KB9病毒全基因組中，構(gòu)建得到可表達(dá)熒光信號(hào)的病毒株SHIV-KB9nefGFP。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒：質(zhì)粒 3’SHIV-KB9、5’SHIVKB9，克隆受體菌E.coli JM109菌株均由中國(guó) CDC性病艾滋病預(yù)防控制中心病毒免疫室保藏;質(zhì)粒pEGFP-C3由南開大學(xué)分子病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 細(xì)胞系：293T細(xì)胞為含有SV 40T抗原基因的人胚腎傳代細(xì)胞系;TZM-bl細(xì)胞為含有 HIV-1 LTR和luc熒光素酶報(bào)告基因，并表達(dá)CD4受體和CXCR4，CCR5輔助受體的人子宮癌細(xì)胞系;恒河猴PBMC分離自新鮮的猴體抗凝全血。

1.1.3 主要試劑：PyrobestTMDNA polymerase高保真DNA聚合酶及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Takara公司;各種限制性內(nèi)切酶、堿性磷酸酶(CIP)、T4 DNA連接酶購(gòu)自New England Biolabs公司;哺乳動(dòng)物細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;SIV p27抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 Coulter公司;Luciferase assay system試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 外源片段GFP基因的擴(kuò)增：以pEGFP-C3質(zhì)粒DNA為模板，通過PCR方法擴(kuò)增出包含CMV啟動(dòng)子和EGFP基因1.4 kb的目的片段。引物中帶有用于克隆的EcoRⅤ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，上游引物為GCG GAT ATC TTA CGG GGT CAT TAG，下游引物為CGC TCT AGA TTA TAG ATC CGG TGG ATCCC。

1.2.2 3’SHIV-KB9nefGFP半長(zhǎng)質(zhì)粒的構(gòu)建：為便于外源片段的插入，利用分子克隆手段在3’SHIVKB9中引入EcoRⅤ酶切位點(diǎn)，突變點(diǎn)位于nef基因起始30 bp的位置。隨后將純化的1.4 kb PCR產(chǎn)物用EcoRⅤ和XbaⅠ雙酶切后回收，攜帶EcoRⅤ酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒載體 3’SHIV-KB9也用 EcoRⅤ和XbaⅠ雙酶切回收，將目的片段和載體DNA連接后，構(gòu)建出攜帶GFP熒光基因的半長(zhǎng)克隆，目的克隆的大小約為8.5 kb。用PvuⅡ?qū)δ康目寺∵M(jìn)行鑒定，篩選PvuⅡ酶切鑒定大小正確的半長(zhǎng)SHIV克隆。

1.2.3 全長(zhǎng)SHIV-KB9nefGFP cDNA克隆的構(gòu)建：將3’SHIV-KB9nefGFP半長(zhǎng)質(zhì)粒用NotⅠ和SphⅠ雙酶切，回收5.5 kb的大片段。攜帶SHIV另外半長(zhǎng)基因的5’SHIV-KB9也用相同的NotI和SphⅠ雙酶切，回收9.1 kb的大片段。將兩個(gè)半長(zhǎng)片段連接起來，構(gòu)建成全長(zhǎng)約14.5 kb的含有完整SHIV全基因組的 cDNA克隆(如圖1所示)。用 BglⅡ?qū)θL(zhǎng)SHIV質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，篩選酶切鑒定大小正確的全長(zhǎng)克隆。

1.2.4 檢測(cè)SHIV-KB9nefGFP熒光蛋白的表達(dá)：將鑒定正確的全長(zhǎng)SHIV cDNA克隆轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系40 h后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況。同時(shí)通過SIV p27試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中核衣殼蛋白表達(dá)情況，并收集病毒上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 檢測(cè)SHIV-KB9nefGFP克隆株的感染活性：在生物安全三級(jí)(P3)實(shí)驗(yàn)室中，將全長(zhǎng)SHIV克隆轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞上清病毒液，過0.45 μm的濾膜，將病毒液感染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的TZM-bl細(xì)胞系，感染 48 h后裂解細(xì)胞，加入luciferase底物上機(jī)讀數(shù)，通過計(jì)算熒光強(qiáng)度判斷克隆株感染活性。

1.2.6 SHIV-KB9nefGFP在恒河猴 PBMC中的復(fù)制：將初步篩選具有感染能力的 SHIV-KB9nefGFP cDNA克隆轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集經(jīng)SIV p27檢測(cè)為陽(yáng)性的病毒上清液，用病毒上清感染PHA刺激3 d的恒河猴PBMC細(xì)胞。PBMC被感染1 d后，用1×PBS洗細(xì)胞，以排除轉(zhuǎn)染上清給實(shí)驗(yàn)帶來的背景誤差。在 PBMC 被感染的第 3、6、9、12、15、18 天，通過SIV p27核心蛋白抗原檢測(cè)，測(cè)定出病毒復(fù)制的動(dòng)力曲線。如果構(gòu)建的重組SHIV病毒具有復(fù)制能力，即可在PBMC培養(yǎng)物上清液中檢測(cè)到新的病毒顆粒的生成。

圖1 SHIV-KB9nefGFP基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Illustration diagram for construction of SHIV-KB9nefGFP.The resultant construct encodes green fluorescent protein with a CMV promoter in nef gene，due to the GFP-NEF junction at the EcoRⅤ and XbaⅠ sites.

2 結(jié)果

2.1 攜帶發(fā)光基團(tuán)SHIV-KB9nefGFP全長(zhǎng)克隆的構(gòu)建

以質(zhì)粒pEGFP-C3為模板通過PCR擴(kuò)增得到包含GFP基因的外源片段，并利用 EcoRⅤ和 XbaⅠ處理載體和外源基因后回收，將兩種片段連接起來，構(gòu)建出含有綠色熒光蛋白基因的 3’SHIVKB9nefGFP半長(zhǎng)質(zhì)粒，并通過酶切鑒定亞克隆的正確性。隨后質(zhì)粒用NotⅠ和SphⅠ雙酶切后回收，此半長(zhǎng)SHIV與另外5’半長(zhǎng) SHIV連接起來，構(gòu)建出含有完整SHIV基因組的全長(zhǎng)約14.5 kb的SHIV cDNA克隆。將所有轉(zhuǎn)化子酶切鑒定，篩選大小正確的克隆株SHIV-KB9nefGFP(圖2)。雖然構(gòu)建了攜帶熒光蛋白基因的全長(zhǎng)SHIV克隆株，但發(fā)光蛋白表達(dá)情況和病毒感染復(fù)制能力是否受影響需要進(jìn)一步的活性檢測(cè)。

2.2 SHIV-KB9nefGFP在293T細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)

通過293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染已構(gòu)建的全長(zhǎng)質(zhì)粒SHIVKB9nefGFP，48 h后收集培養(yǎng)上清，其中應(yīng)包含大量包裝出膜的病毒顆粒。同時(shí)我們利用熒光顯微鏡可以檢測(cè)病毒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)情況，如圖3所示(見封二)，圖 A為轉(zhuǎn)染48 h后普通日光下293T細(xì)胞狀態(tài)，圖B為同一視野熒光顯微鏡下的細(xì)胞狀態(tài)?？梢姴《净蚪M中攜帶的GFP蛋白可以很好的表達(dá)，使得大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞也呈現(xiàn)熒光。

圖2 SHIV-KB9nefGFP全長(zhǎng)克隆多種酶切圖譜Fig.2 Restriction analysis of full-length genome SHIV-KB9nefGFP

2.3 SHIV-KB9nefGFP在TZM-bl細(xì)胞系的感染活性和熒光蛋白表達(dá)

利用收集的293T轉(zhuǎn)染上清感染TZM-bl細(xì)胞，通過病毒感染后TAT蛋白的表達(dá)，激活細(xì)胞基因組中整合的熒光素酶報(bào)告基因，進(jìn)而檢測(cè)病毒的感染能力。結(jié)果如圖4，病毒感染后luc的激活相比本底值超過3倍，說明病毒可以感染TZM細(xì)胞，但與骨架質(zhì)粒SHIV-KB9相比激活倍數(shù)明顯降低，說明外源基因GFP的插入影響了SHIV病毒株部分感染活性。

同時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況(圖5，見封二))。結(jié)果顯示，24 h和48 h觀察TZM細(xì)胞中呈現(xiàn)綠色的細(xì)胞個(gè)數(shù)比例變化較小，且發(fā)光細(xì)胞整體數(shù)量較低。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè) SHIV-KB9nefGFP在 TZM-bl細(xì)胞系的感染活性較弱，能進(jìn)入細(xì)胞的病毒顆粒不多，進(jìn)而也會(huì)影響病毒中GFP在細(xì)胞中的表達(dá)量。

2.4 SHIV-KB9nefGFP在恒河猴PBMC原代細(xì)胞中的感染和復(fù)制能力

使用收集的轉(zhuǎn)染病毒上清感染恒河猴PBMC后，定期收集培養(yǎng)上清液，通過對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)病毒上清液中的p27蛋白含量的檢測(cè)，判斷病毒在天然受體細(xì)胞中的復(fù)制能力(圖6)。與出發(fā)病毒株SHIV-KB9相比，改造后的SHIV-KB9nefGFP感染上清中p27表達(dá)明顯偏低，并在感染后2周不能檢測(cè)到病毒顆粒，推測(cè)插入外源基因后的SHIV病毒在細(xì)胞中的復(fù)制能力明顯降低。

圖4 SHIV-KB9nefGFP病毒感染TZM-bl細(xì)胞后熒光素酶表達(dá)量Fig.4 Luciferase content in the TZM-bl cells after infection with SHIV-KB9nefGFP

圖6 SHIV-KB9nefGFP病毒在恒河猴PBMC細(xì)胞中的復(fù)制Fig.6 Replication of SHIV-KB9nefGFP in rhesus PBMCs

2.5 SHIV-KB9nefGFP在恒河猴PBMC中熒光蛋白的表達(dá)

SHIV-KB9nefGFP病毒感染恒河猴PBMC細(xì)胞后，定期在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。由于PBMC為原代細(xì)胞，病毒感染后會(huì)導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡，因此培養(yǎng)一段時(shí)間后需要補(bǔ)充新鮮細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)每隔7 d補(bǔ)充細(xì)胞1次以確保病毒能夠正常生長(zhǎng)。我們分別在感染后第3、6、9天分別觀察細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光情況，結(jié)果顯示隨著病毒復(fù)制表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量有明顯增加(圖7，見彩插1)。結(jié)合病毒上清中 p27的定量檢測(cè)結(jié)果，證明 SHIV-KB9nefGFP可以有效的感染其天然宿主細(xì)胞恒河猴PBMC，并在有限復(fù)制的過程中正常表達(dá)GFP熒光蛋白。

3 討論

SHIV-KB9病毒可以有效感染恒河猴等靈長(zhǎng)類動(dòng)物，并且在對(duì)病毒易感的印度源恒河猴中可以誘導(dǎo)AIDS樣疾病。因此，常常作為SHIV/恒河猴模型中的攻擊毒株對(duì)候選AIDS疫苗進(jìn)行評(píng)價(jià)，而且還被用于AIDS藥物的評(píng)價(jià)以及HIV致病機(jī)理和免疫反應(yīng)機(jī)制的研究。

綠色熒光蛋白(GFP)在激光下可發(fā)出特殊熒光，被廣泛應(yīng)用于生物體的定位檢測(cè)中。目前國(guó)際上已經(jīng)構(gòu)建成功的利用熒光蛋白標(biāo)記的動(dòng)物免疫缺陷病毒載體只有SIVmac239，該病毒雖然能夠在恒河猴體內(nèi)穩(wěn)定遺傳，并能夠清晰的檢測(cè)到動(dòng)物體內(nèi)的病毒感染情況［16］。但由于其基因全部來源于猴免疫缺陷病毒，與HIV-1存在較大差異，因而不能很好的反應(yīng)HIV-1在體內(nèi)的感染特性。

本研究通過基因操作手段，將強(qiáng)化的綠色熒光蛋白基因(EGFP)克隆至SHIV-KB9病毒全長(zhǎng)基因組中。通過感染實(shí)驗(yàn)和熒光鏡下觀察，確認(rèn)改造后的病毒可以感染細(xì)胞并在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)GFP熒光。然而由于外源片段的插入，使病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因nef失活，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，對(duì)病毒的復(fù)制功能產(chǎn)生了一定影響。研究顯示，SIV nef基因與恒河猴宿主限制性因子BST-2作用相關(guān)，其結(jié)構(gòu)的改變更易在體外表現(xiàn)出對(duì)病毒的抑制作用［17］。因此，SHIV-KB9nefGFP在體內(nèi)的感染活性仍需進(jìn)一步檢測(cè)，并期望通過動(dòng)物體內(nèi)適應(yīng)獲得感染復(fù)制能力更高的發(fā)光毒株，為后期建立 SHIV-EGFP/恒河猴動(dòng)物模型提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Construction and Characterization of a New SHIV Clone Carrying GFP Gene

LI Yue1，SHA Ri-na2，XU Xuan1，QIAO Wen-tao1，SHAO Yi-ming3，YANG Gui-bo3
(1.Center for AIDS Research，Nankai University，Tianjin 300071，China;2.Tianjin Medical College，Tianjin 300222;3.National Center for AIDS/STD Control and Prevention，China CDC，Beijing 102211)

Objective To engineer recombinant strains of simian-human immunodeficiency virus(SHIV)stably expressing green fluorescent protein(EGFP).A replication-competent SHIV construct containing the green fluorescent gene with the ability to infect rhesus monkeys would serve as an important tool in AIDS research.Methods A SHIV strain was constructed by inserting the EGFP genes into the nef gene of SHIV KB9.The infection activity and bright fluorescence expression of the SHIV clone was determined in vitro in TZM-bl cells and macaque PBMCs.Results Replicationcompetent virus and bright fluorescence of infected cells were obtained with one construct，in which EGFP was inserted into the SHIV nef locus.This strain was infectious to rhesus PBMC and TZM-bl cells.Green fluorescing cells were detected by direct microscopic visualization.Conclusions A recombinant and replication-competent SHIV strain expressing EGFP is engineered.It is suggested that the SHIV-KB9nefGFP could be used as a tool to directly detect infected cells and aid in the immunophenotypic characterization of these cells.

HIV-1;SHIV;Animal model;Green fluorescent protein;Infectious activity

R332

A

1671-7856(2011)02-0007-05

2010-09-29

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.02

南開大學(xué)基本科研資助項(xiàng)目(65010681)。

李悅(1982-)，女，講師，從事分子病毒學(xué)和動(dòng)物模型研究工作。莎日娜(1963-)，女，副教授，從事分子病毒學(xué)研究工作。

楊貴波(1964-)，男，研究員，從事動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和粘膜免疫學(xué)研究工作，E-mail：guibyang@public.bta.net.cn。