林 釗，劉 霞 *，李 迎

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

表面等離子體共振技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)研究中的應(yīng)用

林 釗，劉 霞 *，李 迎

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

表面等離子共振(SPR)技術(shù)具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程，只需對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)處理，無需進(jìn)行標(biāo)記，也可以無需純化各種生物組分，耗樣量少，檢測(cè)時(shí)間短，已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域。該技術(shù)不僅可以檢測(cè)分析物，而且可以測(cè)定分子間相互作用的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。目前，SPR在檢測(cè)食品和環(huán)境領(lǐng)域中的農(nóng)藥殘留做了大量的研究工作。本文簡(jiǎn)單介紹SPR的基本原理以及SPR生物傳感器的類型，重點(diǎn)綜述SPR生物傳感器應(yīng)用于農(nóng)藥檢測(cè)中傳感芯片的識(shí)別分子種類，檢測(cè)方法以及目前SPR檢測(cè)農(nóng)藥的研究現(xiàn)狀，最后對(duì)SPR生物傳感器應(yīng)用于農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展前景作出展望。

表面等離子共振(SPR)；傳感器；農(nóng)藥；檢測(cè)

表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)現(xiàn)象自1902年Wood[1]發(fā)現(xiàn)至今已有一百多年的歷史。20世紀(jì)80年代初，Nylander等[2]和Liedberg等[3]首次將SPR技術(shù)用于化學(xué)領(lǐng)域，并成功地研制出第一個(gè)SPR氣體傳感器。從此應(yīng)用SPR傳感器在檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)入了快速發(fā)展階段。目前，SPR技術(shù)已應(yīng)用到生物[4]、藥物[5]、環(huán)境[6]、食品安全[7]等多個(gè)領(lǐng)域。

隨著世界人口的增加和社會(huì)的發(fā)展，人類對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的需求量越來越大，不可避免地對(duì)果蔬使用大量農(nóng)藥。農(nóng)藥的使用不僅會(huì)殘留在果蔬上，也會(huì)污染土壤、水等人類生存的環(huán)境。農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中殘留的農(nóng)藥則會(huì)通過食物鏈等途徑，直接或間接地影響生態(tài)系統(tǒng)的平衡和人類的健康，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致人畜出現(xiàn)急性中毒或造成三致毒性、神經(jīng)毒性、遺傳基因毒性、免疫毒性等慢性危害[8]，因此對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)是十分重要的。近年來發(fā)展了多種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法[9-15]，其中SPR傳感器具有高度的專一性、快速、簡(jiǎn)單、高靈敏、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程、無需標(biāo)記、耗樣量極少等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留的檢測(cè)領(lǐng)域具有明顯的優(yōu)勢(shì)，具有潛在的應(yīng)用前景。

1 SPR工作原理

SPR是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)一束P偏振光以一定的角度入射到棱鏡中，若入射角大于臨界角時(shí)，光線將發(fā)生全內(nèi)反射，在全內(nèi)反射的情況下，電場(chǎng)在金屬與棱鏡的界面處并不立刻消失，而是向金屬介質(zhì)中傳輸振幅呈指數(shù)衰減的消失波。該消失波可引發(fā)金屬薄膜中的自由電子，使其形成表面等離子體(surface plasmon，SP)(圖1中A-2)。當(dāng)入射光波長(zhǎng)為某一適當(dāng)值的條件下，由SP形成的表面等離子波(surface plasmon waves，SPW)與消失波的頻率和波數(shù)相等時(shí)，二者將發(fā)生共振。此時(shí)入射光被吸收，使反射光能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)共振峰(即反射光強(qiáng)度最低值，對(duì)應(yīng)的角度為共振角，見圖1中B-2)。SPR對(duì)金屬表面的介質(zhì)折射率微小變化是極其敏感的，待測(cè)物與金屬薄膜接觸時(shí)若存在吸附、生化反應(yīng)或構(gòu)象的改變，則金屬表面的折射率就會(huì)發(fā)生變化，共振角隨即發(fā)生改變[16-18]，據(jù)此，可對(duì)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)和分析。如圖1中A-1所示，在傳感器金膜表面上固定抗體(生物識(shí)別分子)，然后使游離的抗原緩緩?fù)ㄟ^流通池，當(dāng)抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，SPR的共振角就會(huì)隨之發(fā)生改變(圖1中B-2)，并且隨著反應(yīng)時(shí)間的改變共振角也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，直至抗原-抗體反應(yīng)達(dá)到平衡(圖1中B-3)，共振角也不會(huì)再發(fā)生改變，故通過SPR反射光譜的共振峰的變化可對(duì)抗原進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)。

圖1 SPR傳感器原理示意圖[18]Fig.1 Principle of the surface plasmon resonance sensor[18]

2 SPR傳感器類型

目前常用的SPR傳感器，根據(jù)其耦合器件的不同可分為3種類型，分別為：棱鏡型SPR傳感器、光纖型SPR傳感器和光柵型SPR傳感器[16]：1)棱鏡型SPR傳感器是利用棱鏡做為光的耦合器件，是當(dāng)今世界上應(yīng)用最廣泛的傳感器。該傳感器具有容易再生，使用成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)。早在1990年該傳感器就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商品化，至今為止有眾多公司或機(jī)構(gòu)在研發(fā)和生產(chǎn)，如美國(guó)Biacore AB公司生產(chǎn)的Biacore 1000、Biacore 2000、Biacore 3000，美國(guó)Affinity Sensors公司生產(chǎn)的IASys，日本Nippon Laser Electronics生產(chǎn)的SPR-670，中國(guó)科學(xué)院電子研究所研制的SPR-2000，西班牙SENSIA，SL公司生產(chǎn)的SPR傳感器等[19]。國(guó)內(nèi)外也有不少實(shí)驗(yàn)室使用自組裝棱鏡型的SPR傳感器如：Liu等[20]自組裝的波長(zhǎng)檢測(cè)型的棱鏡型SPR傳感器；2)光纖型SPR傳感器是利用光纖作為光的耦合器件，該傳感器非常容易小型化，具有方便野外作業(yè)的優(yōu)點(diǎn)，但由于其再生性不好，使用成本高，而導(dǎo)致使用程度低于棱鏡型SPR傳感器。Rajan等[21]報(bào)道了利用光纖型的SPR傳感器來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；Tsai等[22]研究了增強(qiáng)的光纖形SPR傳感器信號(hào)的方法；3)光柵型SPR傳感器采用的是衍射光柵耦合入射光，其結(jié)構(gòu)比棱鏡型SPR傳感器復(fù)雜，并且在實(shí)際分析中存在著溶液對(duì)光的吸收問題。與棱鏡耦合入射光的方式相比較，光柵耦合法在計(jì)算方面極其復(fù)雜，無法應(yīng)用麥克斯韋方程去求解邊界條件，因此使用較少[16]。

3 SPR檢測(cè)農(nóng)藥的識(shí)別分子種類及檢測(cè)方法

SPR傳感器首次檢測(cè)農(nóng)藥(除草劑阿特拉津(atrazine)和西瑪津(simazine))是在20世紀(jì)90年代。隨著SPR儀器的發(fā)展和研究的深入，目前已發(fā)展了多種應(yīng)用于SPR檢測(cè)農(nóng)藥的識(shí)別分子和檢測(cè)方法。

3.1 SPR檢測(cè)農(nóng)藥的識(shí)別分子種類

SPR傳感芯片上固定的識(shí)別分子必須具有高度專一性，即結(jié)構(gòu)上具有的特異結(jié)合位點(diǎn)只能與特定生物分子發(fā)生相互作用。不難發(fā)現(xiàn)，只要能跟農(nóng)藥特異性結(jié)合的物質(zhì)都可以考慮作為SPR檢測(cè)農(nóng)藥的識(shí)別分子。根據(jù)近年來的報(bào)道，應(yīng)用于農(nóng)藥檢測(cè)的SPR傳感芯片的識(shí)別分子主要有以下幾種類型。

3.1.1 抗體

抗體作為傳感芯片的識(shí)別分子，一般以農(nóng)藥或其衍生物作為抗原物質(zhì)。利用抗體作為識(shí)別分子檢測(cè)農(nóng)藥是目前世界上應(yīng)用最廣、最普遍的SPR檢測(cè)方法，近年來有大量的文獻(xiàn)報(bào)道[18,23-31]。早在1993年Minunni等[25]將Atrazine的一個(gè)衍生物固定在傳感器表面，Atrazine的抗體與含有除草劑的樣品混合，當(dāng)抗體與固定在傳感器表面的Atrazine衍生物反應(yīng)時(shí)，SPR響應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)度隨著樣品中Atrazine的濃度不同而改變。最低檢測(cè)限為0.05ng/mL，分析時(shí)間為15min。Mouvet等[26]在1997年用Simazine的單克隆抗體Anti-simazine作為識(shí)別分子測(cè)定了地表水中的Simazine，單個(gè)樣品的測(cè)定時(shí)間為22min，檢測(cè)范圍為0.2～2.4μg/L，傳感芯片經(jīng)過約200次重復(fù)測(cè)定后沒有明顯變化，重現(xiàn)性好。

3.1.2 酶

有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制劑，這些農(nóng)藥通過與AChE的活性位點(diǎn)絲氨酸(Ser200)殘基形成共價(jià)鍵從而抑制了AChE的活性[32]，因此可以應(yīng)用AChE作為SPR生物傳感器的生物識(shí)別分子進(jìn)行農(nóng)藥的檢測(cè)。2006年Lin等[33]報(bào)道了以AChE作為識(shí)別分子，利用金納米粒子作為基質(zhì)膜的光纖型SPR傳感器，檢測(cè)對(duì)氧磷。該實(shí)驗(yàn)小組首先將5cm清潔后的裸露光纖浸泡在含有金膠體的溶液中，使光纖表面自組裝單分子層的金納米粒子。然后將修飾了納米金粒子的傳感器芯片浸泡在胱胺鹽酸鹽(cystamine dihydrochloride)溶液中2h，接著在室溫條件下用2.5%戊二醛溶液中浸泡40min，再用水沖洗并風(fēng)干。以上處理使傳感芯片表面固定的醛基與AChE中的胺基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而在傳感芯片上組裝AChE。最后將對(duì)氧磷溶液通入AChE修飾的傳感芯片進(jìn)行檢測(cè)。他們的研究表明，利用酶作為識(shí)別分子檢測(cè)對(duì)氧磷，檢測(cè)上限為0.234nmol/L，該方法檢測(cè)對(duì)氧磷具有高的靈敏度和穩(wěn)定性。

3.1.3 信使核糖核酸(mRNA)

以mRNA作為識(shí)別分子，是由于某種mRNA與特定的農(nóng)藥具有特異性。其檢測(cè)方法是：首先在傳感芯片表面固定親和素，再將生物素化的DNA/RNA探針組裝到親和素上，然后引入mRNA標(biāo)記的農(nóng)藥，由于DNA/RNA探針能與農(nóng)藥特異結(jié)合的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，從而可以進(jìn)行農(nóng)藥的SPR檢測(cè)。親和素是由4個(gè)相同的含128個(gè)氨基酸的亞基組成，并且每一個(gè)亞基含有一個(gè)與生物素結(jié)合的位點(diǎn)，能與生物素或其衍生物形成高度穩(wěn)定的化合物[34]，生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotinhydroxysuccinimide，BNHS)末端羧基可與蛋白質(zhì)、糖類、DNA和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物，而且不影響這類物質(zhì)的生物活性。親和素-生物素[35]的結(jié)合是已知的生物大分子與小分子配體非共價(jià)結(jié)合最強(qiáng)的一例，其具有結(jié)合快，在多種有機(jī)溶液中可穩(wěn)定存在的特點(diǎn)。Lim等[36]在2000年報(bào)道了利用該方法進(jìn)行除草劑Atrazine的檢測(cè)，應(yīng)用的是對(duì)Atrazine具有特異性的釀酒酵母菌的P450 mRNA。該實(shí)驗(yàn)小組首先將鏈霉親和素(streptavidin)固定在SPR傳感芯片的表面，然后將生物素化的寡核苷酸探針(oligonucleotide probes)組裝在鏈酶親和素上，P450 mRNA與寡核苷酸探針發(fā)生互補(bǔ)，從而對(duì)Atrazine進(jìn)行檢測(cè)。他們的研究結(jié)果表明，該方法的SPR響應(yīng)靈敏度有很大的提高，最低檢測(cè)限達(dá)到1pg/mL。

“你不同意，我就跟你把官司打到高院去?！饼埍竽抗鈭?jiān)定地看著竹韻。竹韻沒有回答他，不輕不重地掐了他一把，然后咬咬唇，上前抓住了輪椅扶手。海力先是略略一愣，也馬上上前抓住另一邊扶手，和竹韻一起推著龍斌慢慢走出了法庭。

3.1.4 光合反應(yīng)中心(reaction centers，RCs)

光系統(tǒng)Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)是植物類囊體膜的一種光合作用單位，它含有兩個(gè)捕光復(fù)合物和一個(gè)光反應(yīng)中心。三嗪類(triazine)除草劑可以取代該光反應(yīng)中心的主要組分D1蛋白上的第二個(gè)醌結(jié)合位點(diǎn)(QB)，從而抑制光合作用中的光反應(yīng)，因此可以利用該方法對(duì)三嗪類除草劑進(jìn)行檢測(cè)。但由于Alsoother類除草劑也可以與D1蛋白結(jié)合，故其特異性不佳[37-38]。一些研究者通過研究紫細(xì)菌(purple bacterial)的RCs后，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)和功能均與植物的D1蛋白相似，能與QB結(jié)合，并且與Triazine類除草劑結(jié)合強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他除草劑，因此RCs也可以作為識(shí)別分子，應(yīng)用于SPR檢測(cè)Triazine類除草劑。在2000年，Nakamura等[39]報(bào)道了一種直接檢測(cè)三嗪類除草劑的方法，該小組應(yīng)用的檢測(cè)方法是利用紫細(xì)菌(purple bacterium)的RCs。他們將組氨酸標(biāo)記的RCs固定在SPR傳感器芯片表面上，并利用鎳-氨基三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid)作為橋梁結(jié)合一個(gè)Triazine類除草劑Atrazine。他們的研究發(fā)現(xiàn)Atrazine在0.1～1μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與SPR的響應(yīng)信號(hào)呈比例關(guān)系，并且應(yīng)用RCs組裝傳感芯片的方法直接檢測(cè)農(nóng)藥的靈敏度高于應(yīng)用抗體組裝傳感芯片的方法。他們[40]在2003年還報(bào)道了將大量亞基組氨酸標(biāo)記的反應(yīng)中心(heavy-subunit-histidine-tagged RCs，HHisRCs)固定在傳感芯片表面作為識(shí)別分子(圖2)，由于HHisRCs會(huì)與Atrazine發(fā)生化學(xué)的螯合作用而結(jié)合，從而能夠檢測(cè)Atrazine。同時(shí)他們還對(duì)含氯除草劑敵草隆(DCMU)和2-甲,4-氯丙酸(MCPP)進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。他們的研究表明Atrazine的最低檢測(cè)限為1μg/mL，DCMU的最低檢測(cè)限為20μg/mL，MCPP信號(hào)不明顯。

圖2 阿特拉津與反應(yīng)中心結(jié)合過程[40]Fig.2 Schema of atrazi binding to the RC[40]

3.2 檢測(cè)方法

由于小分子很難引起足夠大的折射率變化， 所以一般情況下SPR檢測(cè)分子質(zhì)量小于500D的物質(zhì)較困難[41-42]。農(nóng)藥屬于小分子物質(zhì)，因此利用SPR傳感器對(duì)農(nóng)藥的直接檢測(cè)靈敏度還不是很高[43]。鑒于此，研究人員采取一些增強(qiáng)SPR檢測(cè)信號(hào)的方法進(jìn)行農(nóng)藥的SPR檢測(cè)。

3.2.1 競(jìng)爭(zhēng)法

所謂的競(jìng)爭(zhēng)法是指先在芯片表面固定半抗原-蛋白交聯(lián)物，然后注入被分析物與固定濃度的抗體混合液，使表面固定的半抗原和溶液中的被分析物競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)合溶液中抗體的方法(圖3)，當(dāng)溶液中被分析物濃度減少時(shí)則芯片表面結(jié)合的抗體就多，SPR響應(yīng)信號(hào)就大。因此SPR傳感器的響應(yīng)信號(hào)與被分析物濃度成反比。競(jìng)爭(zhēng)法可明顯提高SPR檢測(cè)小分子的靈敏度，是目前檢測(cè)農(nóng)藥的最常用的方法。Dostalek等[23]利用競(jìng)爭(zhēng)法來檢測(cè)Atrazine和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)，該研究小組首先把牛血清白蛋白和Atrazine結(jié)合物(BSA-atrazine)，牛血清白蛋白和2,4-D結(jié)合物(BSA-2,4-D)組裝在傳感器芯片上。接著將Atrazine標(biāo)準(zhǔn)品溶解在氰化甲烷(acetonitrile)中，質(zhì)量濃度為1mg/mL；2,4-D標(biāo)準(zhǔn)品則準(zhǔn)備在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，質(zhì)量濃度為20μg/mL。然后分別用PBS把上述兩種溶液稀釋成10-3～103ng/mL一系列質(zhì)量濃度，并逐一與10μg/mL的單克隆抗體混合后，注入SPR傳感器進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)組裝在傳感器表面的農(nóng)藥和固定抗體濃度的混合溶液中的農(nóng)藥(農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品)競(jìng)爭(zhēng)相同數(shù)量的抗體。他們通過競(jìng)爭(zhēng)法增強(qiáng)SPR響應(yīng)信號(hào)得到的Atrazine和2,4-D最低檢測(cè)限分別為0.07ng/mL和0.16ng/mL。Mauriz等[24]利用競(jìng)爭(zhēng)法，比較了單一和同時(shí)分析毒死蜱(有機(jī)磷類)、西維因(氨基甲酸酯類)、DDT(有機(jī)氯類)3種農(nóng)藥，得出單一和同時(shí)分析的最低檢測(cè)限分別為：DDT：32ng/L和18ng/L；毒死蜱：54ng/L和52ng/L；西維因：1.38μg/L和0.05μg/L。他們的研究表明：DDT和西維因同時(shí)分析的靈敏度高于單一分析，毒死蜱在單一和同時(shí)分析時(shí)靈敏度十分接近。Kim等[44]利用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)2,4-D，得到的最低檢測(cè)限為0.1ng/mL。

圖3 競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.3 Schema of the competitive immunoassay format

3.2.2 三明治夾心法

傳統(tǒng)的三明治夾心法就是將抗體固定在SPR傳感器芯片的表面，然后引入抗原，使其與固定在芯片表面的抗體結(jié)合，此時(shí)加入二抗增強(qiáng)SPR響應(yīng)信號(hào)[16]。該方法是利用在傳感器芯片上結(jié)合更多的物質(zhì)，使得SPR信號(hào)增強(qiáng)的一種方法(圖4)。Shimomura等[45]利用三明治夾心法進(jìn)行了Atrazine的檢測(cè)，他們先在傳感器表面組裝Atrazine抗體(anti-atrazine)，然后注入含有Atrazine和辣根過氧化物酶(HRP)的混合溶液。Atrazine和HRP也能發(fā)生特異性結(jié)合，混合溶液中同時(shí)存在Atrazine和Atrazine-HRP兩種物質(zhì)。當(dāng)Atrazine和Atrazine-HRP與Anti-atrazine特異性結(jié)合后，最后注入HRP的抗體(antibody against HRP)，在質(zhì)量濃度為5ng/mL的Atrazine樣品中檢測(cè)到信號(hào)放大比率為1.9。

圖4 三明治夾心法Fig.4 Schema of the sandwich method

3.2.3 利用銀膜作為傳感芯片

SPR研究的是反射光譜，選擇不同的金屬材料作為構(gòu)成表面等離子體共振的基質(zhì)膜將會(huì)對(duì)SPR光譜產(chǎn)生很大的影響，所以要首先考慮反射率較高的金屬，在可見光范圍內(nèi)，金屬Ag、Al、Au、Cu的反射率高，Au的反射率雖然不如Ag膜，但它的穩(wěn)定性最好，故SPR最常用Au膜作為基質(zhì)膜[46]。但由于銀的高反射率，也有研究者應(yīng)用銀膜進(jìn)行農(nóng)藥的檢測(cè)。Rajan等[21]利用Ag作為基質(zhì)膜的光纖型SPR傳感器檢測(cè)了毒死蜱，該研究小組利用蒸鍍技術(shù)在纖芯直徑為600μm和0.40數(shù)值孔徑的光纖上蒸鍍了一層大約55nm厚銀膜。在鍍膜前先要除去光纖上約20cm包層，然后再用丙酮清洗，接著把清洗后的的光纖置于真空室中，調(diào)節(jié)真空室氣壓為1.33322×10-4Pa。在真空處理15min后，加熱烘烤20min，完成烘烤5min后，真空管完全打開直到真空狀態(tài)完成。最后增加電壓直到銀完全蒸發(fā)，待冷卻后從真空室取出，銀膜厚度約55nm。使用該方法檢測(cè)毒死蜱，最低檢測(cè)濃度為0.1μmol/L。應(yīng)用Ag作為基質(zhì)膜要現(xiàn)鍍現(xiàn)用，并采取措施保護(hù)Ag膜防止其氧化。

3.2.4 金納米粒子(gold nanoparticles，AuNPs)

應(yīng)用AuNPs是增強(qiáng)SPR響應(yīng)信號(hào)的一種有效手段，尤其適用于小分子物質(zhì)的檢測(cè)。由于AuNPs本身的折射率大以及AuNPs的表面等離子體子與金膜本身的表面等離子體子發(fā)生了耦合[16](圖5)，引入AuNPs可明顯提高SPR傳感器靈敏度。金納米粒子已成功地應(yīng)用于生各種物分子的標(biāo)記，如酶[47]和DNA[48]和抗體[48-52]等，利用金納米粒子標(biāo)記除草劑Atrazine抗體也有相關(guān)報(bào)道[53]。2009年Huang等[43]報(bào)道了利用AuNPs標(biāo)記氨基甲酸鹽(carbamate)農(nóng)藥從而提高SPR響應(yīng)信號(hào)的方法。該研究小組利用AuNPs標(biāo)記Carbamate的過程如下，首先把Carbamate置于酒精溶液中配制成合適的濃度。接著在持續(xù)攪拌條件下緩慢滴加AuNPs溶液，在室溫、黑暗環(huán)境中保存過夜。然后以1200r/min的速度離心10min，收集沉淀物，用PBS緩沖液調(diào)制成懸浮液。最后利用紫外可見光譜對(duì)該耦合物表征，以確認(rèn)Carbamate已被AuNPs標(biāo)記。他們首先將酶固定在經(jīng)過巰基十一酸修飾SPR芯片上，然后通入AuNPs標(biāo)記的Carbamate，進(jìn)行檢測(cè)。他們的檢測(cè)結(jié)果顯示利用AuNPs增強(qiáng)SPR信號(hào)方法檢測(cè)兩個(gè)不同醚鍵的Carbamate 4a與4b，最低檢測(cè)限分別達(dá)到7.0pmol/L和12pmol/L。2008年Valera等[53]研究了利用金納米粒子標(biāo)記Atrazine抗體，進(jìn)行Atrazine的高靈敏SPR檢測(cè)。2010年該研究小組[54]利用金納米粒子標(biāo)記Atrazine的抗體，擴(kuò)大SPR信號(hào)，檢測(cè)紅酒中的Atrazine，實(shí)驗(yàn)得到的最低檢測(cè)限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐洲標(biāo)準(zhǔn)中紅葡萄酒的Atrazine最大殘留量(50μg/kg)的標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 金納米粒子增強(qiáng)法Fig.5 Schema of SPR biosensor based on AuNPs signal enhancement

4 SPR 檢測(cè)農(nóng)藥的研究現(xiàn)狀

目前從國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀來看，SPR技術(shù)對(duì)農(nóng)藥殘留的研究主要集中于環(huán)境監(jiān)控和飲用水中的殺蟲劑和除草劑檢測(cè)。

4.1 有機(jī)磷類殺蟲劑檢測(cè)

20世紀(jì)40年代，施拉德的第一個(gè)有機(jī)磷殺蟲劑進(jìn)入德國(guó)市場(chǎng)后，這一領(lǐng)域有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。至今為止，有機(jī)磷農(nóng)藥超過了300個(gè)品種[55]。隨之應(yīng)用SPR生物傳感器檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的研究也逐漸增多。

Mauriz等[29]利用SPR生物傳感器檢測(cè)有機(jī)磷酸酯類殺蟲劑毒死蜱。他們應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行檢測(cè)，先將農(nóng)藥與BSA結(jié)合，然后固定在SPR傳感器芯片上。檢測(cè)到毒死蜱的最低檢測(cè)限為50pg/mL左右，檢測(cè)芯片經(jīng)過200次的再生循環(huán)靈敏度沒有發(fā)生明顯的改變。2006年該實(shí)驗(yàn)小組[56]對(duì)實(shí)際樣品地表水和飲用水中的毒死蜱進(jìn)行檢測(cè)，利用抗體作為生物識(shí)別分子，通過研究得到毒死蜱的最低檢測(cè)限為55ng/L，檢測(cè)時(shí)間約20min。Yang等[57]也有應(yīng)用SPR Biacore 3000和光流環(huán)共振器(opto-fluidic ring resonator，OFRR)兩種儀器分別檢測(cè)機(jī)磷農(nóng)藥的報(bào)道。Kaufiman等[58]報(bào)道了應(yīng)用SPR測(cè)定農(nóng)藥有機(jī)磷和甲基2-苯并咪唑氨基甲酸酯。

4.2 苯氧羧酸類除草劑檢測(cè)

苯氧羧酸類除草劑在環(huán)境中容易被降解[55]，但在大量使用的情況下也會(huì)在環(huán)境形成殘留，利用SPR檢測(cè)苯氧羧酸類除草劑的研究開展得較早，在20世紀(jì)末已有關(guān)于檢測(cè)此類農(nóng)藥的報(bào)道。

1998年，Revoltellalr等[59]利用SPR、酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫(radioimmunoassay，RIA)技術(shù)3種方法分別對(duì)2,4-D進(jìn)行檢測(cè)。他們研究結(jié)果表明利用SPR方法檢測(cè)2,4-D，在0.001～1.0mg/L范圍內(nèi)呈線形，因而SPR更適合檢測(cè)2,4-D。2000年Svitel等[27]利用兩種方法檢測(cè)2,4-D，并進(jìn)行了對(duì)比。方法一是在傳感器芯片上直接固定牛血清白蛋白和2,4-D耦合物(BSA-2,4-D)，然后注入2,4-D單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，最后用葡萄糖再生；方法二是首先在傳感芯片上修飾一層葡聚糖，接著在葡聚糖上固定伴刀豆蛋白A和2,4-D耦合物(Con-A-2,4-D)，然后注入2,4-D單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，最后用葡萄糖再生。結(jié)果顯示第一種檢測(cè)方法不能再生；第二種檢測(cè)方法再生性好，在兩個(gè)月內(nèi)進(jìn)行約200次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果沒有顯著差異。Kaur等[28]報(bào)道利用A蛋白(protein A)作為連接層，分別將BSA-2,4-D和BSA-atrazine的耦合物固定在傳感芯片的表面，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)了2,4-D和Atrazine。Gobi等[60]報(bào)告了利用物理的吸附作用把2,4-D-BSA組裝到傳感芯片的表面的方法，進(jìn)行2,4-D的SPR檢測(cè)。他們的研究發(fā)現(xiàn)，利用這種方法所制造的芯片檢測(cè)2,4-D在重復(fù)使用20次左右都具有良好的重現(xiàn)性。隨后，該研究小組[30]同樣利用靜電吸附作用，分別在SPR傳感芯片表面固定BSA-2,4-D耦合物與卵清蛋白和2,4-D耦合物(OVA-2,4-D)，利用競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行了2,4-D的檢測(cè)，BSA-2,4-D與OVA-2,4-D的最低檢測(cè)限分別是0.5nmol/L和0.1nmol/L。Kim等[61]研究了應(yīng)用SPR技術(shù)直接對(duì)自然界水體中的2,4-D進(jìn)行檢測(cè)。Soh等[62]也報(bào)道了采用競(jìng)爭(zhēng)法對(duì)二惡英的前體物質(zhì)2,4-D的SPR檢測(cè)。

4.3 三氮苯類除草劑的檢測(cè)

三氮苯類化合物的除草活性于1952年被發(fā)現(xiàn)，1957年商品化。這類化合物至今仍是很有價(jià)值的旱田除草劑，以用于玉米田的Atrazine最為突出[55]。SPR對(duì)此類除草劑的研究也較多，特別是針對(duì)Atrazine的檢測(cè)。

Chegel等[41]利用SPR生物傳感器檢測(cè)了抑制光合作用的農(nóng)藥Atrazine，該方法是將蛋白質(zhì)D1固定在傳感芯片金膜的表面，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)D1中的質(zhì)體醌遇到Atrazine時(shí)，Atrazine會(huì)將質(zhì)體醌置換，從而可利用SPR生物傳感器來檢測(cè)Atrazine。該實(shí)驗(yàn)小組利用以上原理對(duì)Atrazine的水溶液進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)范圍為0.05～5.0μg/mL。2007年Farré等[63]報(bào)道了利用一種便攜式的SPR生物傳感器檢測(cè)水中的Atrazine。首先在傳感器金膜芯片表面用烷基硫醇(alkanethiolate)修飾，然后固定Atrazine的衍生物。將Atrazine樣品和多克隆抗體混合后，注入SPR的流通池并進(jìn)行分析。最低檢測(cè)限穩(wěn)定在20pg/mL，該傳感器的循環(huán)再生時(shí)間大約需要25min。Sasaki等[64]利用有機(jī)硅修飾SPR傳感芯片，再將Atrazine單克隆抗體固定在芯片表面。用SPR分別測(cè)定添加了0.05μg/L Atrazine的河水與0.05μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，研究結(jié)果表明兩者有十分接近的響應(yīng)值。Strachan等[65]利用對(duì)Atrazine具有特異性的單鏈抗體片段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，他們的研究表明來源于植物和細(xì)菌的兩種單鏈抗體片段，與單克隆抗體比較有相似的結(jié)合比率。但是單體的植物和細(xì)菌單鏈抗體片段，與二聚的單鏈抗體片段和單克隆抗體在固定抗原方面相比較，呈現(xiàn)出較低的親合力。Kusharyoto等[66]利用SPR Biacore 3000研究了幾種不同的抗原結(jié)合片段(fragment of antigen binding，F(xiàn)ab)與Atrazine的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。Nabok等[67]還報(bào)道了利用特異性抗體固定在傳感芯片表面，分別對(duì)Atrazine和Simazine進(jìn)行檢測(cè)。Harris等[68]利用抗Simazine的IgG抗體與抗Simazine Fab片段分別檢測(cè)Simazine，得到的最低檢測(cè)限前者為0.16μg/L，后者為0.11μg/L。

4.4 有機(jī)氯類殺蟲劑、氨基甲酸酯類殺蟲劑和其他類型殺蟲劑的檢測(cè)

有機(jī)氯類農(nóng)藥曾是世界上應(yīng)用最廣泛的殺蟲劑。1939年瑞士化學(xué)家保羅·米勒制成DDT，從此開始了生產(chǎn)和使用有機(jī)氯農(nóng)藥的歷史[55]。由于DDT在環(huán)境中不容易降解，并且DDT會(huì)通過生物富集作用存在于食品中，許多國(guó)家已經(jīng)禁止使用。但是直到目前，DDT在環(huán)境中的殘留情況還是比較嚴(yán)重。氨基甲酸酯類殺蟲劑因其有高的生物活性和選擇性以及易于生物降解等特點(diǎn)而成為農(nóng)藥中的一大類。近年來SPR對(duì)其的研究也有報(bào)道。

2006年Mauriz等[12]利用自組裝單分子膜(SAM)的形式在裸露的傳感芯片表面固定巰基烷酸，由于巰基烷酸的巰基端可與金相互作用發(fā)生鍵合并穩(wěn)定的吸附在金膜上，巰基烷酸的羧基端作為活性基團(tuán)，通過EDC/NHS激活后可與抗體連接。并用抗體作為識(shí)別分子檢測(cè)西維因，得到的最低檢測(cè)限為1.38μg/L。同一年，該研究小組也利用該方式，檢測(cè)了含量不超過歐洲法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的天然水中DDT、毒死蜱、西維因3種有機(jī)污染物[69]。Mauriz等[70]也利用SPR生物傳感器檢測(cè)DDT，其檢測(cè)方法是競(jìng)爭(zhēng)法。他們先將DDT衍生物固定在自組裝烷基硫醇單分子膜的傳感芯片上，分別利用DDT的單克隆抗體、DDT與其代謝物的單克隆抗體，用競(jìng)爭(zhēng)法來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示單獨(dú)檢測(cè)DDT的最低檢測(cè)限是15pg/mL，DDT與其代謝物的最低檢測(cè)限是31pg/mL。Keegan等[71]分別利用SPR和超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS-MS)對(duì)牛奶樣品中的苯并咪唑氨基甲酸酯進(jìn)行檢測(cè)，該實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)SPR更適合用于苯并咪唑氨基甲酸酯檢測(cè)。2004年Obataya等[72]報(bào)道了把縮氨酸固定在芯片表面，應(yīng)用SPR技術(shù)對(duì)農(nóng)藥中間體二氯苯胺進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)縮氨酸對(duì)二氯苯的識(shí)別具有特異性。Devlin等[73]報(bào)道了利用SPR技術(shù)對(duì)聯(lián)吡啶類除草劑百草枯(paraquat)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單鏈抗體片段對(duì)百草枯的特異性與Fab片段相似。在生物殺蟲劑方面，Gunning等[74]報(bào)道了，利用SPR研究棉鈴蟲酯酶與蘇云金桿菌殺蟲劑Cry1Ac毒素的相互作用。等[75]研究了農(nóng)藥二苯脲的單克隆抗體-抗原復(fù)合物，獲得IgG和其Fab片段的鍵合動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)，他們的研究表明，隨著溫度的下降，兩者的鍵合能力增強(qiáng)，在15min內(nèi)便可完成0.1μg/L半抗原的測(cè)定。

5 SPR檢測(cè)農(nóng)藥的現(xiàn)存問題及解決方法

根據(jù)SPR檢測(cè)農(nóng)藥的研究現(xiàn)狀，存在的問題與解決措施主要有以下幾個(gè)方面：1)農(nóng)藥多屬小分子物質(zhì)，SPR檢測(cè)小分子物質(zhì)的靈敏度還有待于提高。以往研究提高SPR檢測(cè)小分子靈敏度的方法，主要集中在利用競(jìng)爭(zhēng)法代替直接法，目前隨著新材料的運(yùn)用(如納米材料)、新技術(shù)的發(fā)展(如SPR與其他儀器的聯(lián)用)、新方法的出現(xiàn)(如多檢測(cè)方法結(jié)合)，在不久的將來這一瓶頸極其有可能被突破。2)目前SPR的檢測(cè)成本比較高，一次性使用的傳感芯片是檢測(cè)成本居高不下的重要因素。據(jù)此，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開展傳感芯片循環(huán)再生的相關(guān)研究工作。3)SPR應(yīng)用于農(nóng)藥檢測(cè)的研究開展的相對(duì)較晚，實(shí)際推廣使用的條件還不夠成熟，并且面臨著很多的挑戰(zhàn)(如重現(xiàn)性)，但是隨著今后實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化以及研究的進(jìn)一步深入，SPR檢測(cè)農(nóng)藥技術(shù)的推廣使用必將會(huì)成為現(xiàn)實(shí)。

6 SPR檢測(cè)農(nóng)藥的發(fā)展前景

盡管SPR應(yīng)用于農(nóng)藥的檢測(cè)已經(jīng)做了很多研究工作，針對(duì)目前農(nóng)藥檢測(cè)的現(xiàn)狀和SPR檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，SPR技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥檢測(cè)可以向以下方面發(fā)展：1)對(duì)于有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)，用酶作為生物識(shí)別分子，可以考慮利用其他來源更廣、成本更低并且具有特異性的酶類，代替乙酰膽堿酯酶，比如：利用植物膽堿酯酶，以降低實(shí)驗(yàn)成本，有利于SPR技術(shù)用于檢測(cè)農(nóng)藥的推廣使用。2)在目前SPR檢測(cè)微生物領(lǐng)域中出現(xiàn)了一種識(shí)別分子：噬菌體[76-77]。利用噬菌體作為識(shí)別分子，可以嘗試尋找并建立SPR檢測(cè)微生物源農(nóng)藥(天然源農(nóng)藥如阿維菌素)的方法。3)利用多種方法結(jié)合，以增大SPR的響應(yīng)信號(hào)，如金納米粒子增強(qiáng)SPR信號(hào)法與三明治法結(jié)合使用。4)目前SPR對(duì)農(nóng)藥檢測(cè)的研究主要集中在3類殺蟲劑和兩類除草劑，分別是：有機(jī)磷類殺蟲劑、氨基甲酸酯類殺蟲劑、有機(jī)氯類殺蟲劑和苯氧羧酸類除草劑、三氮苯類除草劑。而有機(jī)氮類、擬除蟲菊酯類、有機(jī)金屬類的研究較少；雜環(huán)類檢測(cè)主要集中于有機(jī)污染物方面。在以后的SPR研究中可擴(kuò)大檢測(cè)農(nóng)藥的種類，使得SPR檢測(cè)農(nóng)藥的應(yīng)用范圍更廣。

隨著SPR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與成熟， SPR技術(shù)將在農(nóng)藥殘留的檢測(cè)中發(fā)揮越來越重要的作用，為農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)控提供一種高靈敏、實(shí)時(shí)、方便、快捷的檢測(cè)方法。

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Recent Advances in Application of Surface Plasmon Resonance in Determining Pesticide Residues

LIN Zhao，LIU Xia*，LI Ying
(Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Surface plasmon resonance (SPR) has been widely applied in various fields owing to its simplicity, low cost, no labeling, high selectivity, and real-time monitoring. SPR can be used not only for detecting analytes, but also determining kinetic parameters of molecular interactions. Interest in the development of SPR based immunosensors for the detection of low molecular weight pesticides in foods and environment has been rapidly increased over the last ten years. In this paper, the SPR principle and instrument types are briefly introduced. The category of recognized molecules immobilized on the SPR sensor surface, detection methods and their applications in pesticide detection are introduced emphatically. In addition, trends of SPR in the area of pesticide detection are also prospected.

surface plasmon resonance (SPR)；sensor；pesticide；detection

TS207.53

A

1002-6630(2011)05-0342-09

2010-07-12

湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目(10B050)；長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(K1005181-21)；

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才基金項(xiàng)目(08YJ07)；湖南省研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX2010B281)

林釗(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c控制。E-mail：linq004@163.com

*通信作者：劉霞(1976—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與分析。E-mail：liuxia608@gmail.com