亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        瑣瑣葡萄總黃酮在體外對乙型肝炎病毒的影響

        2011-10-18 04:17:12李海波
        食品科學 2011年5期
        關(guān)鍵詞:細胞培養(yǎng)抑制率黃酮

        劉 濤,馬 龍,*,趙 軍,李海波

        (1.新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院毒理學教研室,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,新疆 烏魯木齊830004;3.江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 南通 226006)

        瑣瑣葡萄總黃酮在體外對乙型肝炎病毒的影響

        劉 濤1,馬 龍1,*,趙 軍2,李海波3

        (1.新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院毒理學教研室,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,新疆 烏魯木齊830004;3.江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 南通 226006)

        目的:考察瑣瑣葡萄總黃酮體外抗乙型肝炎病毒(HBV)的效果。方法:用HBV DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細胞所得的HepG 2.2.15細胞株為模型,ELISA法測定用藥后8d細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量,計算瑣瑣葡萄總黃酮對HBsAg和HBeAg分泌的抑制率,熒光定量PCR法測定HBV DNA的變化,MTT比色法檢測細胞毒性。結(jié)果:瑣瑣葡萄總黃酮在12.5~100μg/mL范圍內(nèi),均能不同程度地減少細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的含量,且細胞毒性小,半數(shù)中毒劑量(TC50)為284.91μg/mL,對HBsAg半數(shù)有效劑量(IC50)為327.56μg/mL、對HBeAg為215.34μg/mL,對HBsAg治療指數(shù)(TI)為0.87、對HBeAg治療指數(shù)為1.32;總黃酮質(zhì)量濃度100μg/mL時對HBV DNA的抑制率為47.63%。結(jié)論:瑣瑣葡萄總黃酮具有一定的體外抗HBV作用。

        瑣瑣葡萄;總黃酮;乙型肝炎病毒;細胞培養(yǎng)

        乙型肝炎病毒(HBV)感染不僅會導(dǎo)致急慢性乙型肝炎的發(fā)生,而且與肝硬化、原發(fā)性肝癌關(guān)系密切。近年來,國內(nèi)外對傳統(tǒng)天然藥物的抗病毒研究日益重視,抗乙肝病毒藥物研究雖然取得了一些進展,但目前仍缺乏比較理想的治療藥物[1]。因此,從豐富的中草藥植物資源中尋找新的有效抗HBV藥物,已成為我國抗病毒中藥發(fā)展的必然趨勢。1987年,美國Sells等[2]將帶有HBV DNA全基因組及抗G418的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株Hep G建立了2.2.15細胞株,它能長期穩(wěn)定地向細胞培養(yǎng)上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane’s顆粒,是目前體外篩選和評價抗乙肝病毒藥物較理想的細胞模型[3]。黃酮是維吾爾藥瑣瑣葡萄(Vitis vinifer L.)的主要組成成分之一[4],具有調(diào)節(jié)免疫[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗輻射[9]等多種生物活性。課題組前期研究顯示瑣瑣葡萄總黃酮對免疫性肝損傷具有較好的保護作用[10],且對肝癌細胞HepG2的增殖具有顯著的抑制作用[11]。為探討瑣瑣葡萄總黃酮的抗HBV效應(yīng),本實驗以Hep G 2.2.15細胞株為模型,研究瑣瑣葡萄總黃酮在體外抗HBV的生物活性。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        HepG 2.2.15細胞株購自武漢大學物種保藏中心,傳代于高糖DMEM培養(yǎng)基(每1000mL含100萬單位青霉素、1.0g鏈霉素、100mg G418和10%滅活胎牛血清)中培養(yǎng)。

        DMEM培養(yǎng)基、G418(Geneticin)、青霉素-鏈霉素美國Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青生物制品公司;HBsAg和HBeAg ELISA檢測試劑盒 上海華美生物工程公司;HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑盒 上海申友生物技術(shù)有限公司;噻唑藍(MTT) 美國Amresco公司;二甲基亞砜(DMSO)、0.025%胰蛋白酶-EDTA美國Sigma公司;拉米夫定(3-TC,批號06120028) 葛蘭素史克制藥蘇州有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        CO2培養(yǎng)箱 美國Napco公司;XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司;生物安全柜 美國Labconco公司;XD 711型酶標儀 上海迅達醫(yī)療器械有限公司;Thermo IEC冷凍高速離心機 美國熱電公司;Opticon實時熒光定量PCR儀 美國MJ Research公司;AB104-N型分析天平 Mettler-Toledo上海有限公司。

        1.3 瑣瑣葡萄總黃酮的制備

        瑣瑣葡萄藥材粉碎后以去離子水回流提取2次,每次1h,合并提取液,減壓濃縮至一定量,加入5倍體積95%乙醇,充分混勻,靜置12h,過濾得濾液A。藥渣以8倍量95%乙醇回流提取2次,每次1h,合并提取液,減壓濃縮至浸膏,浸膏以水混懸后,石油醚萃取脫脂,再經(jīng)乙酸乙酯萃取,其中乙酸乙酯部分減壓濃縮后,以95%乙醇溶解,放置12h,析出沉淀,過濾得濾液B;濾液A、濾液B及乙酸乙酯萃取后液體合并,減壓濃縮,上AB-8 型大孔吸附樹脂,依次以水、50%和95%乙醇進行梯度洗脫,收集50%乙醇洗脫餾分,減壓濃縮,真空干燥,即得瑣瑣葡萄總黃酮。按參考文獻[12]方法測定其總黃酮含量為35.28%。

        1.4 細胞毒性實驗

        細胞接種48h后,傾去培養(yǎng)基,分別加入含不同質(zhì)量濃度樣品培養(yǎng)基培養(yǎng),第4天換含同樣樣品的培養(yǎng)基,8d后加入5mg/mL的MTT溶液,每孔10μL,37℃孵育4h后,加入DMSO,每孔150μL,混勻,使甲臢完全溶解,用酶標儀在490nm波長處測定吸光度(A給藥組)。以相同條件、相同體積不含樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞作為對照,測定其吸光度(A細胞對照組),按公式(1)計算細胞抑制率,求出半數(shù)中毒劑量(TC50)。空白組為測定時平行操作的空白對照組,測定吸光度(A空白組)。

        1.5 藥物活性實驗

        實驗設(shè)無藥物細胞對照組、不同質(zhì)量濃度藥物組及陽性對照組和空白對照組。HepG 2.2.15細胞接種48h后,傾去培養(yǎng)基,各質(zhì)量濃度藥物組分別加入含瑣瑣葡萄總黃酮(100、50、25、12.5μg/mL)的培養(yǎng)基、各質(zhì)量濃度陽性對照組分別加入含3-TC(100、10、1μg/mL)的培養(yǎng)基,每孔200μL,每個質(zhì)量濃度3個復(fù)孔,同時每板各設(shè)6個細胞對照孔加入同體積無藥物培養(yǎng)基作為細胞對照組,置37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每4d換含同樣樣品的培養(yǎng)基,第8天分別收集細胞培養(yǎng)上清液,置-20℃保存?zhèn)溆?,待測HBsAg、HBeAg和HBV DNA。

        1.6 HBsAg和HBeAg的檢測

        采用ELISA試劑盒測定細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的濃度,以P/N(即樣品的吸光度與空白對照吸光度的比值)表示。根據(jù)公式(2)計算各濃度藥物對HBsAg和HBeAg的抑制率,計算半數(shù)有效濃度IC50。

        式中:A給藥組為不同質(zhì)量濃度的藥物實驗組的吸光度;A空白組為試劑盒測定時不加酶結(jié)合底物而平行操作的空白對照組;A細胞對照組為不加藥物處理的細胞對照組。

        結(jié)合細胞毒性實驗所得TC50計算各樣品的治療指數(shù)(TI),綜合判斷藥物效果。TI= TC50/IC50,TI>2為有效低毒;1<TI≤2為低效有毒;TI≤1為受試物毒性大,不宜于用于抗HBV治療。

        1.7 HBV DNA的測定

        按照HBV DNA熒光定量PCR試劑盒說明書操作,測定細胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA的拷貝數(shù)。根據(jù)公式(3)計算各受試物對HBV DNA的抑制率。

        式中:C給藥組為不同質(zhì)量濃度的藥物實驗組的HBV DNA拷貝數(shù);C細胞對照組為不加藥物處理的細胞對照組的HBV DNA拷貝數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 瑣瑣葡萄總黃酮對HepG 2.2.15細胞的毒性作用

        MTT法測定細胞抑制率,結(jié)果顯示瑣瑣葡萄總黃酮及3-TC對Hep G 2.2.15細胞的毒性較小,其TC50分別為284.91μg/mL 和244.77μg/mL(表1、2)。

        表1 瑣瑣葡萄總黃酮體外抗HBV效果Table 1 Inhibition effects of total flavones from Vitis vinifer L. on HBV in vitro

        表2 瑣瑣葡萄總黃酮的治療指數(shù)Table 2 Therapeutic indexes of total flavones from Vitis vinifer L. for HBsAg and HbeAg

        2.2 瑣瑣葡萄總黃酮對HBsAg和HBeAg分泌的影響

        在瑣瑣葡萄總黃酮和3-TC對HepG 2.2.15細胞分泌HBsAg的IC50分別為327.56μg/mL和315.37μg/mL,其TI為0.87和0.78;對HBeAg的IC50分別為215.34μg/mL和9051.01μg/mL,其TI分別為1.32和0.03,提示在此實驗條件下,瑣瑣葡萄總黃酮抑制HepG 2.2.15分泌HBsAg和HBeAg的效果均優(yōu)于3-TC(表1、2)。

        2.3 瑣瑣葡萄總黃酮對HBV DNA的影響

        瑣瑣葡萄總黃酮對HepG 2.2.15細胞分泌HBV DNA的抑制作用隨質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強,而3-TC可顯著抑制HBV DNA的分泌,各質(zhì)量濃度組DNA拷貝數(shù)<103,超出試劑盒檢測下限(表1)。

        3 討 論

        瑣瑣葡萄為葡萄科小無核紅葡萄品系藥食兼用植物,藥用果實,主產(chǎn)于我國新疆吐魯番、和田、鄯善等地[13];在維吾爾醫(yī)臨床主要應(yīng)用于脾胃不和、頭暈腰酸、神志不安以及小兒麻疹和肝炎等病癥的治療[14-15],為探討瑣瑣葡萄的抗病毒藥效,本研究應(yīng)用Hep G 2.2.15細胞株對瑣瑣葡萄總黃酮進行了抗HBV活性篩選,結(jié)果顯示:瑣瑣葡萄總黃酮用藥8d后,對HepG 2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg具有顯著抑制作用,半數(shù)有效劑量(IC50)HBsAg為327.56μg/mL、HBeAg為215.34μg/mL,治療指數(shù)(TI)分別為HBsAg 0.87、HBeAg 1.32,抑制效果均優(yōu)于陽性對照藥物拉米呋啶,且藥物細胞毒性較小,半數(shù)中毒劑量(TC50)為284.91μg/mL;而瑣瑣葡萄總黃酮對HBV DNA也表現(xiàn)出一定的抑制作用,在100μg/mL時抑制率達到47.63%。細胞培養(yǎng)具有易于控制實驗條件和均衡性好的特點,但體外實驗研究結(jié)果不能反映體內(nèi)所特有的免疫調(diào)節(jié)及代謝對藥物效果的影響。因此,本研究結(jié)果雖然顯示瑣瑣葡萄總黃酮在體外具有一定的抗HBV生物學活性,與維吾爾醫(yī)臨床應(yīng)用效果相一致,但進一步證實其抗病毒作用還須結(jié)合體內(nèi)實驗來確定,其作用機制也有待于深入研究。

        [1] 王靈臺. 中西醫(yī)治療慢性乙型肝炎的問題和對策[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2009, 29(7): 583-584.

        [2] SELLS M A, CHEN M L, ACS G, et al. Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84(4): 1005-l009.

        [3] 成軍, 斯崇文. HBV DNA轉(zhuǎn)然細胞系的建立及應(yīng)用研究進展[J]. 國外醫(yī)學: 流行病與傳染病分冊, 1994, 21(2): 60-64.

        [4] 馬龍, 劉濤, 向陽, 等. 新疆葡萄中3種生物活性物質(zhì)的含量分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志, 2006, 18(1): 28-31.

        [5] 汪敏, 王維民, 諶素華. 芒果皮黃酮的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 食品研究與開發(fā), 2010, 31(8): 23-25.

        [6] 王海敏, 虞海霞, 董蕊, 等. 苕子蜜總酚酸和總黃酮含量測定及抗氧化活性的研究[J]. 食品科學, 2010, 31(1): 54-57.

        [7] 王嵐, 康琛, 楊偉鵬, 等. 藤梨根正丁醇提取物和總黃酮苷抗腫瘤作用研究[J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(16): 2184-2186.

        [8] 何忠梅, 白冰, 王慧, 等. 千里光總黃酮體外抗腫瘤和抗病毒活性研究[J]. 中成藥, 2010, 32(12): 2045-2047.

        [9] 雷筱芬, 陳木森. 黃酮類化合物抗輻射研究進展[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報, 2007, 29(6): 1039-1042.

        [10] 劉濤, 馬龍, 趙軍, 等. 瑣瑣葡萄總黃酮對小鼠免疫性肝損傷保護作用的研究[J]. 新疆醫(yī)科大學學報, 2007, 30(11): 1226-1229.

        [11] 張琳, 馬龍, 劉濤, 等. 瑣瑣葡萄提取物多糖、黃酮對肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用[J]. 新疆醫(yī)科大學學報, 2009, 32(5): 529-532.

        [12] 中華人民共和國國家藥典委員會編. 中國藥典: 一部[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2005: 247.

        [13] 劉勇民. 維吾爾藥志[M]. 烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1999: 496.

        [14] 新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳. 維吾爾藥材標準:上冊[M]. 烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1993: 41.

        [15] 劉濤, 馬龍, 堵年生. 葡萄的生物學作用研究進展[J]. 自然雜志, 2002,249(2): 84-85.

        Inhibitory Effects of Total Flavones from Vitis vinifer L. on Hepatitis B Virus in vitro

        LIU Tao1,MA Long1,*,ZHAO Jun2,LI Hai-bo3
        (1. Department of Toxicology, College of Public Health, Xinjiang Medical University,830011, China;2. Institute of Materia Medica of Xinjiang,830004, China;3. Nantong Center for Disease Control and Prevention, Nantong 226006, China)

        Objective: To investigate the inhibitory effects of total flavones from Vitis vinifer L. on hepatitis B virus (HBV)replication and their toxicity in cultured human hepatocellular liver carcinoma cell line HepG 2.2.15 transfected with HBV DNA.Methods: After 8 days of treatment with total flavones from Vitis vinifer L., the contents of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant of HepG 2.2.15 were measured by ELISA to calculate the inhibitory rates against the secretion of HBsAg and HBeAg, the change in HBV DNA was monitored by real-time PCR, and cytotoxicity test was performed using MTT assay.Results: Addition of total flavones from Vitis vinifer L. in a dosage range of 12.5 to 100μg/mL could reduce the contents of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant of HepG 2.2.15 to different extents. Little cytotoxic effect was observed with a median toxic concentration (TC50) of 284.91 μg/mL. The median effective doses (IC50) on HBsAg and HBeAg were 327.56 μg/mL and 215.34 μg/mL, and the therapeutic index for HBsAg and HbeAg were 0.87 and 1.32, respectively. Total flavones from Vitis vinifer L. at 100 μg/mL could inhibit HBV DNA by 47.63%. Conclusion: Total flavones from Vitis vinifer L. have inhibitory effects on HBV in vitro.

        Vitis vinifer L;flavones;hepatitis B virus;cell culture

        R965

        A

        1002-6630(2011)05-0270-03

        2010-06-17

        國家自然科學基金項目(30660157)

        劉濤(1974—),女,副教授,博士,主要從事新疆特色藥食兼用植物開發(fā)應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail:xjmult@sina.com

        *通信作者:馬龍(1957—),男,教授,碩士,主要從事新疆特色藥食兼用植物開發(fā)應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail:xjmult@163.com

        猜你喜歡
        細胞培養(yǎng)抑制率黃酮
        中藥單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
        黑龍江科學(2023年8期)2023-06-04 08:40:58
        血栓彈力圖評估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
        酶解大豆蛋白的制備工藝研究及其在細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究
        日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
        HPLC法同時測定固本補腎口服液中3種黃酮
        中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:40
        MIPs-HPLC法同時測定覆盆子中4種黃酮
        中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:13
        DAD-HPLC法同時測定龍須藤總黃酮中5種多甲氧基黃酮
        中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:50
        3種陰離子交換色譜固定相捕獲細胞培養(yǎng)上清液中紅細胞生成素的效果比較
        色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:32
        瓜馥木中一種黃酮的NMR表征
        采用PCR和細胞培養(yǎng)方法比較流感樣病例不同標本的流感病毒檢出觀察
        久久中文字幕av一区二区不卡| 国产福利一区二区三区在线视频| 国产精品精品自在线拍| 日韩内射美女人妻一区二区三区| 91华人在线| 日韩精品视频av在线观看| 欧美成人精品第一区| 国产一区二区在线视频| 久久国产亚洲AV无码麻豆| 在线视频播放观看免费| 久久精品国产亚洲超碰av| 亚洲狠狠婷婷综合久久久久图片| 日韩高清无码中文字幕综合一二三区| av资源在线播放网站| 一区二区三区人妻少妇| 欧美性猛交xxxx乱大交3| 精品亚洲国产探花在线播放| 视频在线播放观看免费| 极品少妇被黑人白浆直流| 桃花色综合影院| 国产精品一区二区三区精品| 蜜桃成熟时日本一区二区| 亚洲av综合av国产av中文| 国产黄a三级三级三级av在线看| 国产黄片一区视频在线观看| 青青草手机在线观看视频在线观看 | 亚洲av永久无码精品网站在线观看| 免费一区二区三区久久| 激情五月婷婷六月俺也去| 蜜桃一区二区在线视频| 亚洲精品无码久久久久久| 天天干夜夜躁| 精品久久一区二区三区av制服 | 日本va中文字幕亚洲久伊人| 人妻中文字幕无码系列| 欧美日韩另类视频| 日本大片在线一区二区三区| 无码精品国产一区二区三区免费 | 亚洲精品久久久久久| 国产视频精品一区白白色| 国产av剧情刺激对白|