張紅城，孫慶申，王光新,3，由英杰，董 捷,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150080；3.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

張紅城1，孫慶申2，王光新1,3，由英杰2，董 捷1,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150080；3.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

為了研究蜂膠對餐后血糖控制機理，本實驗采用體外α-葡萄糖苷酶抑制模型研究蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法研究其動力學性質(zhì)。結(jié)果表明，蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(0.8260±0.1754)mg/mL，抑制常數(shù)(KI)為(0.0265±0.0060)mg/mL。動力學研究表明，蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為典型的非競爭性抑制。

蜂膠；α-葡萄糖苷酶；非競爭抑制

蜂膠是蜜蜂從植物新生芽孢和樹干處采集的樹膠，并混合自身上腭分泌物和蜂蠟而加工成的一種具有芳香氣味的膠狀黏性物。它不僅是蜜蜂的建筑材料還是它們抵御病源微生物入侵的化學武器[1-3]。蜂膠的化學成分是復雜多變的，不同產(chǎn)地甚至是同一產(chǎn)地的蜂膠，其化學成分存在較大差異，這主要與膠源性植物的生物多樣性有關(guān)。目前，已經(jīng)從蜂膠中鑒定出了300多種的化學成分，包括黃酮類、酚酸類以及其酯類、醇類、酮類、氨基酸類以及各種無機化合物[4-5]。由于蜂膠含有多種活性物質(zhì)，因而具有多種生物活性，如抗氧化[6]、抑菌[7]、消炎[8]、抗病毒[9]、抗癌[10]、保肝[11]及治療糖尿病[12]等作用。

近年來，隨著生活水平的提高，糖尿病逐漸成為危害人體健康的主要疾病之一，因而，尋找有效的糖尿病治療藥物和保健食品成為該領(lǐng)域的研究熱點。α-葡萄糖苷酶是一種能夠催化α-1,4糖苷鍵斷裂，血糖增加不可或缺的酶類，并且第三次亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南也將α-葡萄糖苷酶抑制劑作為降低餐后血糖的一線藥物[13]。蜂膠具有降血糖的作用，但作用機理并沒有深入研究[14]。特別是對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型未見報道過。本研究通過建立體外α-葡萄糖苷酶抑制模型，研究蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其抑制動力學。揭示蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制機理，以期為蜂膠類保健食品的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠乙醇提取物為中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所提供。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase EC3. 2. 1. 20)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG, N1377-1G)、二甲亞砜(DMSO) 美國Sigma公司；磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 北京化學試劑公司；所用的所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子分析天平 中國梅特勒-托利多(上海)有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(配有UV-probe處理軟件) 日本島津公司；恒溫加熱器 臺灣Wealtec公司。

1.3 方法

1.3.1 α-葡萄糖苷酶活力的測定

采用的反應(yīng)體系是參照張麗等[13]的實驗方法，優(yōu)化后為：磷酸緩沖液(pH 7.0 PBS)2.05mL，加入0.5mol/mL的PNPG 1mL，混合均勻后放置在37℃的恒溫加熱器中30min。然后取出，再加入0.1mg/mL的酶液0.7mL，迅速倒入比色皿中，在波長415nm處測定20min，每隔30s記錄一次吸光度，并依據(jù)吸光度確定酶的最適添加量。

1.3.2 抑制率的測定

將蜂膠乙醇提取物用DMSO溶解并配成不同濃度，然后將實驗分成4組，每組進行3次平行實驗。 A：樣品組：分別取不同濃度的蜂膠乙醇提取物0.1mL放入試管中，加入1.95mL PBS和1mL PNPG，37℃恒溫30min。然后取出加入0.7mL酶液，立即倒入比色皿中，在波長415nm處測定其吸光度，所測時間長度及時間間隔和1.3.1節(jié)相同。B：樣品對照組：用0.7mL PBS代替酶液，其他的試劑加入量和測定條件與A組相同，在波長415nm處測定其吸光度。C：對照組：用0.1mL PBS代替蜂膠乙醇提取物溶液，其他與A組相同，測定波長415nm處的吸光度。D：空白組：以0.7mL PBS代替酶液，以0.1mL PBS代替蜂膠乙醇提取物溶液，其他與A相同，測定波長415nm的吸光度。根據(jù)公式(1)計算蜂膠對α-葡萄糖苷酶的抑制率，并利用Excel計算IC50。

式中：A1、A2、A3、A4分別是上述樣品組、樣品對照組、對照組、空白組的吸光度。

1.3.3 酶抑制動力學

將2.0mmol/L PNPG稀釋成0.5、0.6、0.8、1.2、1.6、1.8、2.0mmol/L。分別取不同濃度的PNPG 1mL放入試管中，隨后加入2.05mL PBS，37℃恒溫30min，之后加入0.7mL 酶溶液，立即用UV-2550紫外-可見分光光度計在波長415nm處測其時間掃描圖像，并用UV-probe軟件進行數(shù)據(jù)處理即可得到相應(yīng)的最大速度(Vmax)和米氏常數(shù)(Km)。然后用依次用0.1mL 0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL蜂膠乙醇提取物代替相應(yīng)的PBS，進行上述的Vmax和Km測定。這樣可以得到5組不同的Vmax和Km，再根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法研究抑制機理。實驗每組做3次平行樣。

1.3.4 抑制常數(shù)的確定

蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)通過公式(2)進行計算[15]。

式中：[I]代表的是抑制劑的濃度，而α通過公式(3)進行確定。

式中，Vmax是沒有加入蜂膠乙醇提取物的最大反應(yīng)速度，Vmax※是加入蜂膠乙醇提取物的最大反應(yīng)速度，都可以通過上述酶抑制動力學的實驗獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

圖1 蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of EEP onα-glucosidase

由圖1可知，在蜂膠乙醇提取物質(zhì)量濃度小于1.5mg/mL的時候，隨著質(zhì)量濃度的增加對α-葡萄糖苷酶的抑制率增加較快，當質(zhì)量濃度超過1.5mg/mL時候，抑制增加的緩慢。這可能由于隨著蜂膠乙醇提取物的量增加對α-葡萄糖苷酶的抑制逐漸達到了飽和。IC50為(0.8260±0.1754)mg/mL，如果簡單的從IC50上來說，其比泰國一種叫魔鬼樹的樹葉對α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度要小[16]，這也說明蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制效果要好于一些天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

2.2 蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)

表1 蜂膠乙醇提取物不同質(zhì)量濃度條件下的α-葡萄糖苷酶的Km和VmaxTable 1 Km and Vmax values ofα-glucosidase in the presence of different concentrations of EEP

由表1可知，α-葡萄糖苷酶的Km為(0.4588±0.0367)mmol/L，以及加入和沒有加入蜂膠乙醇提取物兩種情況下的Vmax值，利用上述公式可得α為(1.8953±0.0791)，進而得出蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)(KI)為(0.0265±0.0060)mg/mL。

2.3 酶抑制動力學

圖2 蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的米氏曲線Fig.2 Michaelis-Menten curve ofα-glucosidase inhibited by EEP

圖3 蜂膠乙醇提取物的雙倒數(shù)抑制曲線(不同底物PNPG濃度)Fig.3 Lineweaver-Burk plot of EEP towards the substrate PNPG at different concentrations

由圖2可知，隨著蜂膠乙醇提取物的質(zhì)量濃度增大，Vmax不斷的減小。但隨著底物質(zhì)量濃度的增加速度的變化趨勢并沒有改變，這可能是由于蜂膠乙醇提取物和酶結(jié)合的位點不是酶的催化中心，而是其他位點，說明蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制不是競爭抑制。從圖3可以看到，不論蜂膠乙醇提取物的質(zhì)量濃度如何變化，雙倒數(shù)曲線在X軸的焦點幾乎都是一點，且表1中結(jié)果也顯示Km值之間不存在顯著差異，因此推斷蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶是典型的非競爭抑制。

現(xiàn)有α-葡萄糖苷酶抑制劑的降血糖作用機理表明，抑制劑往往是通過在小腸中和α-葡萄糖苷酶底物競爭性的結(jié)合到催化活性位點，來達到減少底物的分解降低血糖的目的，其作用的機理是明顯的競爭性抑制[17]。但是這種抑制易受到底物濃度的影響，如果存在高濃度的底物的時候這種抑制將變的非常小，甚至達不到抑制的效果。因此當使用這些競爭性抑制劑控制餐后血糖時，也同時要求必須控制飲食。而蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制是典型的非競爭抑制，可以不受到底物濃度的影響，這比競爭性抑制劑將更加有利于控制糖尿病人的餐后血糖。

3 結(jié) 論

蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯，抑制率隨著蜂膠乙醇提取物質(zhì)量濃度的增加而不斷變大，IC50為(0.8260±0.1754)mg/mL，KI為(0.0265±0.0060)mg/mL。表明蜂膠乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶具有很好的親和作用，可以有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性。此外，其對α-葡萄糖苷酶的抑制機理是非競爭性抑制，可以不受底物濃度的影響，這使得蜂膠乙醇提取物有望成為新一代α-葡萄糖苷酶抑制劑，為開發(fā)利用蜂膠資源提供理論依據(jù)。

[1] BURDARK G A. Review of biological properties and toxicity of bee propolis[J]. Food Chem Toxical, 1998, 36: 347-363.

[2] BANSKOTA A H, TEZUKA Y T, KADOTA S. Recent progress in pharmacological research of propolis[J]. Phytother Res, 2001, 15: 561-571.

[3] BHADAURIA M, NIRALA S K, SHUKLA S. Duration-dependent hepatoprotective effects of propolis extract against carbon tetrachloride–induced acute liver damage in rats[J]. Advances in Natural Therapy,2007, 24: 1136-1145.

[4] SHENG Jianchun, ZHOU Jing, WANG Lin, et al. Antioxidant activity of ethanol and petroleum ether extracts from Brazilian propolis[J]. Eur Food Res Technol, 2007, 225: 249-253.

[5] BANKOVA V, CASTRO S L, MARCUCCI M C. Propolis: recent advances in chemistry and plant origin[J]. Apidologie, 2000, 31: 3-15.

[6] RUSSO A, LONGO R, VANELLA A. Antioxidant activity of propolis:role of caffeic acid and phenethyl ester and galangin[J]. Fitoterapia, 2002,73(Suppl 1): S21-S29.

[7] AL-WAILI N S. Clinical and mycological benefits of topical application of honey, olive oil and beeswax in diaper dermatitis[J]. Clin Microbiol Infect, 2005, 11: 160-163.

[8] BORRELLI F, MAFFIA P, PINTO L, et al. Phytochemical compounds involved in the anti-inflammatory effect of propolis extract[J]. Fitoterapia,2002, 73(Suppl 1): S53-S63.

[9] SCHNITZLER P, NEUNER A, NOLKEMPER S, et al. Antiviral activity and mode of action of propolis extracts and selected compounds[J].Phytother Res, 2010, 24(Suppl 1): S20-S28.

[10] EL-KHAWAGA O A, SALEM T A, ELSHAL M F. Protective role of Egyptian propolis against tumor in mice[J]. Clin Chim Acta, 2003, 338(1/2): 11-16.

[11] GONZALEZ R, CORCHO I, REMIREZ D, et al. Hepatoprotective effects of propolis extract on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats[J]. Phytother Res, 1995, 9(2): 114-117.

[12] 郭芳彬. 蜂膠對糖尿病的療效與作用機理探析[J]. 養(yǎng)蜂科技, 2004(5): 32-34.

[13] 張麗, 李彩芳, 李曉梅, 等. 加拿大蓬α-葡萄糖苷酶抑制作用[J]. 河南大學學報: 醫(yī)學版, 2008, 27(4): 39-41.

[14] 董捷, 閆繼紅, 孫麗萍. 蜂膠復合軟膠囊降糖作用的實驗研究[J]. 養(yǎng)蜂科技, 2003(5): 2-4.

[15] 馬蘭戈尼. 酶催化動力學: 方法與應(yīng)用[M]. 趙裕蓉, 張鵬, 譯. 北京:化學工業(yè)出版社, 2007: 56-60.

[16] NIUBON J A, MEGH R B, KAWABATA J. α-Glucosidase inhibitors from Devil tree (Alstonia scholaris)[J]. Food Chemistry, 2007, 103:1319-1323.

[17] XIAO S Z. α -Glucosidase inhibitor[J]. Journal of Japanese Medicine,1999, 20(1): 22-24.

Inhibitory Effect of Ethanol Extract from Propolis onα-Glucosidase

ZHANG Hong-cheng1，SUN Qing-shen2，WANG Guang-xin1,3，YOU Ying-jie2，DONG Jie1,*
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. College of Life Science,Heilongjiang University, Harbin 150080, China；3. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

In order to explore the mechanism by which propolis controls postprandial blood glucose, the inhibitory effect of ethanol extract from propolis (EEP) on α-glucosidase was evaluated by using α-glucosidase inhibition model in this paper.Inhibitory kinetic parameters were determined by Lineweaver-Burk plot. The results indicated that the median inhibitory concentration (IC50) of EEP was (0.8260 ± 0.1754) mg/mL and the inhibition constant (KI) was (0.0265 ± 0.0060) mg/mL. Kinetic analysis showed that the inhibitory mechanism of EEP on α-glucosidase was a typical noncompetitive inhibition. Therefore,propolis seems to be a healthy food choice for the adjustment of blood glucose.

propolis；α-glucosidase；noncompetitive inhibition

TS218

A

1002-6630(2011)05-0108-03

2010-06-29

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項目(NYCYTX-43)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(nyhyzx07-041)

張紅城(1967—)，男，副研究員，博士，主要從事功能食品與生物技術(shù)研究。E-mail：zzhc@sohu.com

*通信作者：董捷(1966—)，女，研究員，碩士，主要從事功能食品與生物活性物質(zhì)研究。E-mail：jiedon@126.com