李新華，楊翠娜，李 丹

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

發(fā)芽和提取條件對(duì)玉米胚芽中超氧化物歧化酶的誘導(dǎo)作用

李新華，楊翠娜，李 丹

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

為提高玉米超氧化物歧化酶(SOD)的活力和提取率，在不同條件下對(duì)玉米進(jìn)行發(fā)芽處理，從發(fā)芽玉米中剝離胚芽，并在磷酸緩沖液中浸泡，再提取SOD，并測(cè)定SOD總活力。結(jié)果表明：玉米在30℃、有光照條件下發(fā)芽4d，剝離的40g胚芽在0.05mol/L 200mL磷酸緩沖液中浸泡36h，通過(guò)膠體磨研磨浸提1h，60℃熱沉淀15min，用1.5倍－20℃的丙酮沉淀SOD，經(jīng)Cellulose-DE-52層析，再經(jīng)SephadexG-75層析，得到的玉米SOD比活力最高，為4487.28U/mg pro，比未發(fā)芽的玉米胚芽提取的SOD的比活力(924.18U/mg pro)提高了3.86倍。

玉米胚芽；發(fā)芽條件；超氧化物歧化酶(SOD)；誘導(dǎo)作用

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是1969年McCord和Fridovich發(fā)現(xiàn)的一種金屬酶，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)，根據(jù)其所含金屬輔基的不同，主要分為3種類型：Cu-SOD、Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD；在鏈霉菌天藍(lán)菌(Streptomyces coelicolor Muller)中還存在著兩種新的SOD：Ni-SOD和Fe-SOD、Zn-SOD[1]。由于SOD能專一地清除超氧陰離子自由基，所以在防御氧中毒、抗輻射損傷以及防御衰老等方面起著十分重要的作用，從而使得對(duì)SOD的研究越來(lái)越引起人們的關(guān)注和重視[1-3]。我國(guó)傳統(tǒng)工業(yè)大多從動(dòng)物血液和內(nèi)臟器官中提取SOD，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，且在存儲(chǔ)、運(yùn)輸?shù)确矫娲嬖谥T多不便，生產(chǎn)成本高，而且動(dòng)物來(lái)源的SOD容易對(duì)人體造成過(guò)敏反應(yīng)，因此人們正逐步轉(zhuǎn)向通過(guò)微生物發(fā)酵和從植物中提取SOD。玉米原料來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉，從玉米中提取SOD的研究已有不少報(bào)道，但多數(shù)是以整粒玉米為原料，而且是在未萌發(fā)的休眠狀態(tài)。SOD屬于誘導(dǎo)酶，在胚芽萌發(fā)過(guò)程中酶活應(yīng)處于提高階段，因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)優(yōu)化玉米發(fā)芽條件，然后從分離出的胚芽中提取SOD，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，確定玉米萌發(fā)最佳的誘導(dǎo)條件和提取純化條件，為提高玉米中SOD的含量及批量提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院。

SephadexG-75 美國(guó)Amersham Pharmacia公司；DE-52纖維 美國(guó)Whatman公司；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；考馬斯亮藍(lán)G-250國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇6000 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；丙酮 沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HL-2S型恒流泵、TH-300梯度混合器、SBS-100自動(dòng)部分收集器、HD-21-2核酸蛋白檢測(cè)儀 上海青浦滬西儀器廠；XWT-S臺(tái)式記錄儀 上海自動(dòng)化儀表三廠；UV-1600紫外分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；膠體磨 沈陽(yáng)市黃河調(diào)壓器廠； 微量進(jìn)樣器 上海高鴿工貿(mào)有限公司；透析袋 北京瑞爾欣德科技有限公司；Sartrius分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米發(fā)芽處理

將在室溫浸泡24h后的玉米置于培養(yǎng)托盤中，覆蓋4層濕潤(rùn)的紗布，在溫度約30℃的溫室大棚內(nèi)培養(yǎng)，分別采用避光和日照處理，在發(fā)芽處理的不同時(shí)間分別取發(fā)芽玉米，剝?nèi)∨哐窟M(jìn)行SOD提取實(shí)驗(yàn)[4]。

1.3.2 玉米SOD的提取

稱取玉米胚芽40g，加入200mL pH7.8、0.05mol/L的磷酸(PBS)緩沖液，經(jīng)膠體磨研磨，浸提1h并不斷攪拌，用8層紗布過(guò)濾，濾液即為粗酶液。測(cè)其蛋白質(zhì)含量和SOD的活性。并與未經(jīng)發(fā)芽處理、直接剝離的胚芽中提取SOD進(jìn)行酶活比較。

1.3.3 玉米SOD的純化

1.3.3.1 熱處理

將粗酶液60℃水浴15min，并用玻璃棒輕輕攪拌，水浴結(jié)束后將酶液立即冷卻至室溫，然后4℃、12000r/min離心20min，棄沉淀，取其上清液。測(cè)其蛋白質(zhì)含量和SOD的活性[5]。

1.3.3.2 丙酮沉淀

測(cè)量熱變性后的酶液體積，將酶液置入4℃冰浴中，加入1.5倍－20℃的丙酮沉淀SOD。丙酮要緩慢加入，并用玻璃棒輕輕攪拌，以防止丙酮局部過(guò)量以及溶液產(chǎn)生大量的熱量，使得蛋白質(zhì)變性。4℃靜置2h，然后4℃、12000r/min離心20min，將沉淀用少量pH7.8的PBS緩沖液溶解，離心去沉淀。測(cè)其蛋白質(zhì)含量和SOD的活性[6]。

1.3.3.3 Cellulose-DE-52層析

裝柱后用3倍柱體積的pH7.8、2.5mmol/L的PBS緩沖液平衡。然后加入樣液5mL，以pH7.8、2.5～200mmol/L PBS緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速0.5mL/min，每管收集3.5mL，并在280nm波長(zhǎng)處自動(dòng)繪制洗脫曲線，收集SOD活性峰的部分洗脫液。測(cè)其蛋白質(zhì)含量和SOD的活性。用聚乙二醇6000濃縮洗脫液[7-9]。

1.3.3.4 SephadexG-75層析

裝柱后，用pH7.8、2.5mmol/L的PBS緩沖液平衡柱，加入1.3.3.3節(jié)制備的濃縮液2mL，以pH7.8、2.5mmol/L PBS緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速0.3mL/min，每管收集3mL，并在280nm波長(zhǎng)處自動(dòng)繪制洗脫曲線，收集SOD活性峰的部分洗脫液。測(cè)其蛋白質(zhì)含量和SOD的活性。用聚乙二醇6000濃縮洗脫并冷凍干燥得純化的SOD酶蛋白[7-9]。

1.3.4 蛋白含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[10]。

1.3.5 SOD活力的測(cè)定

采用黃嘌呤氧化酶法[11]。

式中：A0為對(duì)照管吸光度；A1為測(cè)定管吸光度；n為反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)；C為組織中蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 未發(fā)芽的玉米胚芽中SOD活力

從未經(jīng)處理、直接剝離的胚芽中提取SOD，各步的純化結(jié)果見表1。

表1 玉米胚芽中SOD提取純化結(jié)果Table 1 Summary of extraction and purification of SOD from corn germ

由表1可以看出，未發(fā)芽的玉米胚芽中SOD有一定的活力，經(jīng)過(guò)提取、分離、純化后，總酶活力有一定的損失，但回收率仍能達(dá)到35.06%，比活力能達(dá)到924.18U/mg pro，因此，目前用未發(fā)芽的玉米胚芽提取SOD的生產(chǎn)工藝路線具有一定的意義。

2.2 避光條件下，發(fā)芽時(shí)間對(duì)玉米胚芽中SOD活力的影響

分別測(cè)定避光條件下不同發(fā)芽時(shí)間后玉米胚芽總蛋白含量和SOD總活力，結(jié)果見圖1、2。

圖1 避光條件下發(fā)芽時(shí)間對(duì)玉米胚芽中總蛋白含量的影響Fig.1 Effect of germination time on total protein content of corn germ

圖2 避光條件下發(fā)芽時(shí)間對(duì)玉米胚芽中SOD總活力的影響Fig.2 Effect of germination time on total activity of SOD in corn germ

由圖1可知，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，總蛋白含量呈下降趨勢(shì)，但下降幅度不大。由圖2可知，SOD總活力逐漸增加，當(dāng)發(fā)芽4d時(shí)SOD的總活力最高，超過(guò)4d后，總活力開始下降。因此，用于提取SOD時(shí)，玉米最佳發(fā)芽時(shí)間為4d。

2.3 日照條件下發(fā)芽時(shí)間對(duì)玉米胚芽中SOD活力的影響

分別測(cè)定在日照條件下不同發(fā)芽時(shí)間玉米胚芽總蛋白含量和SOD總活力，結(jié)果見圖3、4。

圖3 光照條件下發(fā)芽時(shí)間對(duì)玉米胚芽中總蛋白含量的影響Fig.3 Effect of light illumination and germination time on total protein content in corn germ

圖4 光照條件下發(fā)芽時(shí)間對(duì)玉米胚芽中SOD總活力的影響Fig.4 Effect of light illumination and germination time on total activity of SOD in corn germ

由圖3可知，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，總蛋白含量呈下降趨勢(shì)，下降幅度不大。由圖4可知，SOD總酶活力逐漸增加，當(dāng)發(fā)芽時(shí)間為4d時(shí)SOD的總活力最高，超過(guò)4d后，酶活力開始下降。其原因同2.2節(jié)。由圖2和圖4對(duì)比可知，發(fā)芽時(shí)間相同時(shí)，接受光照的胚芽SOD總活力高于避光條件下培養(yǎng)的胚芽。說(shuō)明光照有利于SOD的誘導(dǎo)，可提高胚芽中SOD的酶活力和比活力。

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)玉米胚芽中SOD活力的影響

將浸泡24h后的玉米置于培養(yǎng)托盤中，覆蓋4層濕潤(rùn)的紗布，分別在溫室大棚內(nèi)設(shè)定溫度為20、25、28、30、32℃的條件下培養(yǎng)，均接受正常日照。分別測(cè)定不同培養(yǎng)溫度條件下玉米胚芽總蛋白含量和SOD總活力，結(jié)果見圖5、6。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)玉米胚芽中總蛋白含量的影響Fig.5 Effect of incubation temperature on total protein content in corn germ

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)玉米胚芽中SOD總活力的影響Fig.6 Effect of incubation temperature on total activity of SOD in corn germ

由圖5可知，玉米胚芽中的總蛋白含量隨培養(yǎng)溫度的變化不明顯。從圖6可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，SOD總活力呈上升趨勢(shì)，尤其當(dāng)溫度高于25℃時(shí)，SOD總活力迅速增加?？梢姼邷赜兄谟衩着哐縎OD的誘導(dǎo)，為了提高SOD的總活力，應(yīng)該提高玉米發(fā)芽的溫度。綜合考慮，培養(yǎng)溫度應(yīng)該選擇30℃左右。

2.5 浸泡時(shí)間對(duì)玉米胚芽中SOD活力的影響

分別取等量未發(fā)芽的玉米、避光條件下發(fā)芽的玉米和日照條件下發(fā)芽的玉米，浸泡12、24、36、48、60h后測(cè)定玉米胚芽總蛋白含量和SOD總活力，結(jié)果見圖7。

圖7 浸泡時(shí)間對(duì)玉米胚芽中SOD總活力的影響Fig.7 Effect of soaking time on total activity of SOD in corn germ

由圖7可知，3種玉米胚芽的SOD總活力均隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)浸泡時(shí)間為36h時(shí)，SOD總活力達(dá)到最高，之后隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)總酶活力迅速降低。磷酸緩沖液的浸泡有助于SOD的誘導(dǎo)，但隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液中酸的含量逐漸升高，溶液的pH值逐漸降低，不利于SOD的浸提，因此浸泡時(shí)間應(yīng)控制在36h左右。綜上，磷酸緩沖液的浸泡有助于誘導(dǎo)SOD，但時(shí)間不宜超過(guò)36h。

2.6 最佳條件下玉米胚芽SOD提取結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳SOD誘導(dǎo)條件，在光照條件下30℃發(fā)芽4d的玉米中剝離胚芽，用0.05mol/L的磷酸緩沖液將胚芽浸泡36h，然后經(jīng)過(guò)膠體磨研磨、熱處理、丙酮沉淀、Cellulose-DE-52層析，SephadexG-75層析，最終SOD的比活力能達(dá)到4487.28U/mg pro，比未發(fā)芽的玉米胚芽提取的SOD的比活力924.18U/mg pro提高了3.86倍。

3 結(jié) 論

3.1 未發(fā)芽的玉米胚芽中SOD有一定的活力，經(jīng)過(guò)提取、分離、純化后，總酶活有一定的損失，但回收率仍能達(dá)到35.06%，比活力能達(dá)到924.18U/mg pro。

3.2 經(jīng)浸泡的玉米籽粒在光照條件下30℃發(fā)芽4d，剝離出的胚芽加入0.05mol/L的磷酸緩沖液浸泡36h。浸泡好的胚芽經(jīng)膠體磨破碎研磨后，4℃下浸提1h，冷凍離心，60℃水浴15min熱沉淀，用1.5倍－20℃的丙酮沉淀，Cellulose-DE-52層析，SephadexG-75層析，是玉米胚芽SOD誘導(dǎo)、提取、分離和純化的最佳條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)上述過(guò)程，40g經(jīng)發(fā)芽處理的胚芽最終提取的SOD比活力為4487.28U/mg pro，比未經(jīng)處理的玉米胚芽提取的SOD比活力提高了3.86倍。

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Effects of Germination and Extraction Conditions on SOD Activity in Corn Germ

LI Xin-hua，YANG Cui-na，LI Dan
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Corn germ was harvested during germination in a light or dark environment at different levels of temperature, and immersed in 0.05 mol/L phosphate buffer at pH 7.8 for different periods of time before SOD extraction and subsequent SOD activity measurement in order to explore the effects of germination and extraction conditions on SOD activity in corn germ. A maximum SOD specific activity of 4487.28 U/mg was obtained after the following operations: corn germination for 4 d under light illumination at 30 ℃, immersing of resulting corn germ in 200 mL of 0.05 mol/L phosphate buffer at pH 7.8 for 36 h, milling on a colloid miller, extraction for 1 h, thermal precipitation at 60 ℃ for 15 min, SOD precipitation from the supernatant by adding a 1.5-fold volume of －20 ℃ acetone, and sequential separation on cellulose-DE-52 and SephadexG-75 chromatographic columns, which exhibited a 3.86-fold increase in comparison with ungerminated corn germ (924.18 U/mg).

corn germ；germination condition；superoxidase dismutase(SOD)；induction

S513

A

1002-6630(2011)05-0096-04

2010-05-13

李新華(1955—)，男，教授，碩士，主要從事糧油加工與轉(zhuǎn)化研究。E-mail：lixh.syau@163.com