李 斌，孟憲軍*，薛 雪，吳 倩，李元甦，汪艷群

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

北五味子乙素清除自由基及體外抑菌作用的研究

李 斌，孟憲軍*，薛 雪，吳 倩，李元甦，汪艷群

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

對五味子乙素進行清除自由基及體外抑菌實驗。結(jié)果表明：五味子乙素對自由基的清除效果明顯，其中對羥自由基清除作用大于相同質(zhì)量濃度的VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.2mg/mL；對超氧陰離子自由基清除作用小于VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.24mg/mL。五味子乙素提取液對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用，其中對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌濃度為0.25mg/mL，對根霉、黑曲霉、南洋酵母無明顯抑菌活性。

五味子；乙素；清除自由基；抑菌

五味子為木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.) Baill)的果實，習(xí)稱“北五味子”?！吨腥A人民共和國藥典》中規(guī)定其果實、種子、藤莖均可入藥[1]。其廣泛分布于我國東北部山區(qū)，它的干燥成熟果實為臨床常用的滋補性中藥，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[2]。木脂素類成分是五味子的主要藥用成分[3-5]，主要具有抗腫瘤、抗病毒、保肝、抗衰老等[6]作用。五味子乙素作為五味子木脂素的主要活性成分之一[7]，伴隨著人們對木脂素的研究而備受關(guān)注。近年來研究表明，五味子乙素具有保肝、抗癌、抗?jié)兊人幚碜饔茫呀?jīng)被應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域中[8-9]。但國內(nèi)外目前對于五味子乙素單體的體外抗氧化研究多集中在體內(nèi)組織抗氧化能力[10]，而對體外抗氧化能力研究的相關(guān)報道較少；關(guān)于五味子提取物抑菌作用研究，多在五味子總木脂素混合物的抑菌作用研究[11]，其中木脂素單體的抑菌作用和機理研究較少。

本實驗采用將超臨界萃取五味子粉末，液相色譜制備后的五味子乙素提取液進行清除自由基及抑菌作用的研究[12-16]，為開發(fā)北五味子深加工產(chǎn)品提供依據(jù)，也為五味子乙素的研發(fā)提供新的可利用資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子，2009年10月采于遼寧省新賓縣，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)趙百鎖副教授鑒定為北五味子。

五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 上海同田生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、硫酸亞鐵、鄰菲羅琳、抗壞血酸、鄰苯三酚、濃硫酸、濃鹽酸、雙氧水、無水乙醇、甲醇、三羥甲基氨基甲烷均為分析純 沈陽化學(xué)試劑廠。

細(xì)菌：枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色念珠菌(Candida albicans)、沙門氏菌(Salmonella)；真菌：南洋酵母(Nanyang yeast)、黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus)。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；電熱恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；電子分析天平 上海天平儀器廠；Hzp-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FT-IR200型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司； 5890高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 五味子乙素提取液清除自由基研究

1.3.1.1 五味子乙素提取液清除羥自由基的測定

采用超臨界CO2提取五味子粉末，在壓力30MPa，溫度40℃，粒度40目，時間2h條件下，得到五味子乙素的提取率為3.519mg/g，采用制備液相Symmetry C18色譜柱分離，以甲醇-水為流動相，配比70:30洗脫，收集31.2～32.4min五味子乙素提取液。稀釋收集五味子乙素提取液，使五味子乙素的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，另配制相同質(zhì)量濃度梯度的抗壞血酸溶液作比較。

五味子乙素提取液結(jié)構(gòu)鑒定：五味子乙素提取液進行紅外光譜和HPLC測定，根據(jù)目標(biāo)成分的峰面積的百分比得出其純度。

參照Fenton反應(yīng)體系及林硯淋等[17]的方法進行改進，依次加入反應(yīng)液。反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴鍋中，準(zhǔn)確反應(yīng)90min后，立即取出并迅速測定其在536nm波長處的吸光度(蒸餾水作參比，便于提高精度，測3次，取平均值)。清除率的計算如式(1)所示。

式中：A0為空白組的吸光度；A1為加入0.03%雙氧水的吸光度；A樣品為加入樣品和0.03%雙氧水的吸光度。

1.3.1.2 五味子乙素提取液清除超氧陰離子自由基的測定

樣品制備：稀釋分離純化后的五味子乙素提取液，使五味子乙素的質(zhì)量濃度分別為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，另配制相同質(zhì)量濃度梯度的抗壞血酸溶液作比較。具體步驟參照鄰苯三酚自氧化法[18-19]，在波長325nm處測定吸光度。

式中：A00為空白組吸光度；A01為加入鄰苯三酚溶液的吸光度；A10為加入樣品溶液的吸光度； A325為加入樣品和鄰苯三酚溶液的吸光度。

1.3.2 五味子乙素提取液抑菌作用測定

1.3.2.1 藥液制備

將分離純化后的五味子乙素凍干粉末，用乙醇配制成質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1、2、4、8mg/mL溶液，備用。

1.3.2.2 菌種活化

將融化的培養(yǎng)基裝入試管，滅菌后擺斜面。在無菌條件下用劃線法將供試菌種移接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)18～24h，進行菌種斜面活化。

1.3.2.3 供試菌株懸浮液的制備

將活化好的菌種，在無菌條件下，每種分別挑取兩環(huán)菌苔，各用無菌水稀釋，配制成一定濃度的菌懸液。

1.3.2.4 含菌平板制作

將新鮮配制的培養(yǎng)基于121℃條件下滅菌，當(dāng)培養(yǎng)基冷至50～60℃時，于超凈工作臺上將培養(yǎng)基倒入滅菌的90mm培養(yǎng)皿中，每皿15～20mL培養(yǎng)基，待平板冷卻后，每皿中加入0.5mL菌懸液，用三角玻璃涂棒均勻涂成薄板備用。

1.3.2.5 抑菌作用測定

參照管碟法，在已放至室溫的培養(yǎng)基上等距均勻放3個已滅菌的牛津杯，在其中兩個牛津杯內(nèi)用微量移液器加入等量不同質(zhì)量濃度的五味子乙素提取液，另外一個作為對照，加入等量乙醇溶液，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次，37℃培養(yǎng)24h，觀察并測量抑菌環(huán)直徑，比較抑菌效果(抑菌圈在15mm以上，抑菌能力強；抑菌圈在10～15mm，抑菌能力較強；抑菌圈在10mm以下，抑菌能力弱)。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子乙素提取液清除自由基

2.1.1 五味子乙素結(jié)構(gòu)鑒定

圖1為將HPLC純化后五味子乙素提取液經(jīng)凍干后的五味子乙素的紅外光譜圖，樣品在2959cm-1處有吸收峰，為—CH2伸縮振動峰，說明乙素結(jié)構(gòu)中有烷基的存在。樣品在1619cm-1左右處有吸收峰，為芳環(huán)骨架振動引起的很強的吸收峰，說明了乙素結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)的存在。樣品在1418cm-1左右處有吸收峰，為羧基的C＝O的伸縮振動峰，說明了乙素結(jié)構(gòu)中有羧基的存在。樣品在1329cm-1處有吸收峰，為羧基的C＝O的對稱伸縮振動峰，說明了乙素有羧基的存在。樣品在1046cm-1處有吸收峰，為—OH的變角振動峰，說明了乙素結(jié)構(gòu)中有羥基的存在。鑒定后的基團與圖2中五味子乙素結(jié)構(gòu)符合，基本判定樣品為五味子乙素。圖4為五味子乙素提取液的HPLC圖與圖3五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC對照，根據(jù)五味子乙素成分的峰面積的百分比得出其純度(純度≥98%)。

圖1 五味子乙素的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of schisandrin B from Schisandra chinensis

圖2 五味子乙素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of schisandrin B

圖3 五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.3 HPLC profile of schizandrin B standard

圖4 五味子乙素提取液HPLC圖Fig.4 HPLC profile of schisandrin B from Schisandra chinensis

2.1.2 五味子乙素提取液清除羥自由基

圖5 五味子乙素提取液清除羥自由基能力Fig.5 Comparison of hydroxyl radical scavenging effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B and vitamin C

由圖5可知，在0.1～0.5mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，二者對羥自由基清除作用較好，并且其清除效果都與其質(zhì)量濃度有一定的關(guān)系，隨質(zhì)量濃度的增加，對自由基的清除效果增強。另外，總體上五味子乙素提取液對羥自由基清除作用大于VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.2mg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5mg/mL，其清除率接近100%，而抗壞血酸的半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.26mg/mL。

2.1.3 五味子乙素提取液清除超氧陰離子自由基

圖6 五味子乙素提取液清除超氧陰離子自由基能力Fig.6 Comparison of superoxide anion radical scavenging effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B and vitamin C

由圖6可知，在0.1～0.5mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，五味子乙素和VC二者對超氧陰離子自由基清除作用都較好，清除效果也都與其質(zhì)量濃度有一定的關(guān)系，隨質(zhì)量濃度的增加，對自由基的清除效果增強?？箟难釋Τ蹶庪x子自由基清除作用總體上大于五味子乙素提取液，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.16mg/mL，而五味子乙素提取液的半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.24mg/mL。

2.2 五味子乙素提取液的抑菌作用

表1 不同質(zhì)量濃度的五味子乙素提取液對細(xì)菌生長的抑制作用Table1 Antibacterial effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B at different concentrations

表2 五味子乙素提取液對供試菌的最低抑菌濃度Table 2 MIC of Schisandra chinensis-derived schisandrin B against tested bacteria

由表1、2可知，五味子乙素提取液在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對供試的幾種細(xì)菌都有抑菌活性，其中對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(圖7)，最低抑菌濃度為0.25mg/mL，對沙門氏菌和大腸桿菌的抑制作用最弱，最低抑菌濃度為1mg/mL。同時根據(jù)抑菌圈的變化，五味子乙素提取液對供試菌的抑制作用與其質(zhì)量濃度也有一定的關(guān)系，總體上隨著其質(zhì)量濃度的提高，抑菌作用增強。

圖7 五味子乙素提取液對金黃色葡萄球菌(a)和白色念珠菌(b)抑制作用Fig.7 Bacteriostasis of Schisandra chinensis-derived schisandrin B against Staphylococcus aureus and Candida albicans

表3 不同質(zhì)量濃度的五味子乙素提取液對真菌生長的抑制作用Table 3 Anti-fungal effects of Schisandra chinensis-derived schisandrin B at different concentrations

由表3可知，在0.25～8mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對供試的3種真菌抑菌活性較弱，特別是兩種霉菌，基本沒有抑菌圈的出現(xiàn)，雖然南陽酵母在五味子乙素質(zhì)量濃度為4mg/mL時產(chǎn)生抑菌圈，但抑菌圈較小，抑制能力較弱。

3 結(jié) 論

3.1 五味子乙素提取液對自由基清除效果明顯，其中對羥自由基清除作用大于相同質(zhì)量濃度的VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度0.2mg/mL；對超氧陰離子自由基清除作用小于VC，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.24mg/mL。

3.2 五味子乙素提取液對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用，其中對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌濃度為0.25mg/mL，對根霉、黑曲霉、南陽酵母無明顯抑菌活性。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 王振中. 五味子的藥理研究進展[J]. 時珍國藥研究, 1996, 7(2): 119-121.

[3] 李國成, 邱凱峰, 劉恩桂, 等. 北五味子藤莖的化學(xué)成分研究[J]. 中藥材, 2006, 29(10): 1045-1047.

[4] GU Wei, WEI Nanyu, WANG Zhezhi. LC analysis of lignans from Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils[J]. Chromatographia, 2008, 67(11/12): 979-983.

[5] CHOI Y H, KIM J, JEON S H, et al. Optimum SFE condition for lignans of Schisandra chinensis fruits[J]. Vieweg Verlag, 2006, 48(9/10): 695-699.

[6] DENG Xinxiu, CHEN Xiaohui, CHENG Weiming, et al. Simultaneous LC-MS quantification of 15 lignans in Schisandra chinensis(Turcz)Baill.fruit[J]. Chromatographia, 2008, 67(7/8): 559-566.

[7] 仰榴青, 徐佐旗, 吳向陽, 等. 薄層掃描法同時測定南、北五味子提取物中四種木脂素的含量[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(11): 401-403.

[8] 王英范, 郜玉剛, 劉雅婧, 等. 五味子乙素抗梅花鹿源BVDV的實驗研究[J]. 特產(chǎn)研究, 2006(2): 5-8.

[9] 孫成仁, 彭正松. 北五味子的抑菌作用[J]. 四川師范學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版, 1993, 14(3): 200-202.

[10] 高連用. 五味子乙素對小鼠肝谷光甘肽抗氧化系統(tǒng)的作用[J]. 中草藥, 1996, 27(4): 251-252.

[11] 劉華英. 北五味子木脂素提取工藝及提取物抑菌作用的研究[D]. 吉林: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[12] 郭春梅. 不同產(chǎn)地的五味子中五味子乙素含量測定[J]. 黑龍江醫(yī)藥,2003, 16(1): 6-7.

[13] PENG Jinyong, FAN Guorong, QU Liping, et al. Application of preparative high-speed counter- current chromatography for isolation and separation of schizandrin and gomisin A from Schisandra chinensis[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1082(2): 203-207.

[14] SCHWARZINGER C, KRANAWETTER H. Analysis of the active compounds in different parts of the Schisandra chinensis plant by means of pyrolysis-GC/MS[J]. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly,2004, 135(9): 1201-1208.

[15] TIAN K, QI S D, CHEN Y Q, et al. Separation and determination of lignans from seeds of Schisandra species by micellar electrokinetic capillary chromatography using ionic liquid as modifier[J]. Chromatography A, 2005, 1078(1/2): 181-187.

[16] ZHANG Shouqin, ZHU Junjie, WANG Changzhen. Novel high pressure extraction technology[J]. International Journal of Pharmaceutics,2004, 27(8): 471-472.

[17] 林硯淋, 王志良, 陳婷, 等. 菊花葉中總黃酮提取及對自由基清除作用的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2010, 21(11): 2993-2995.

[18] RUCH R J, CHENG S J, KLAUNIG J E. Prevention of cytotoxicity and inhibition of intercellular communication by antioxidant catechins isolated from Chinese green tea [J]. Carcino Genesis, 1989, 10: 1003-1008.

[19] 仇農(nóng)學(xué), 王宏, 趙雁武. 蘋果渣中多酚物質(zhì)的體外抗氧化活性研究.中國農(nóng)業(yè)工程學(xué)會2005學(xué)術(shù)年會論集[C]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)工程學(xué)會, 2005: 108-111.

Free Radical-scavenging and Antimicrobial Activities of Schisandrin B from Schisandra chinensis

LI Bin，MENG Xian-jun*，XUE Xue，WU Qian，LI Yuan-su，WANG Yan-qun(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Schisandrin B obtained from the fruits of Schisandra chinensis by supercritical carbon dioxide extraction and subsequent preparative HPLC separation was tested for its free radical-scavenging and antimicrobial activities in vitro. The results showed that Schisandra chinensis-derived schisandrin B had higher hydroxyl radical scavenging effect (IC50 = 0.2 mg/mL)but lower superoxide anion radical scavenging effect (IC50 = 0.24 mg/mL) when compared with vitamin C at the same concentrations. The compound could inhibit Staphylococcus aureus, Candida albicans, Salmonella, E.coli and Bacillus subtilis,especially against Candida albicans and Staphylococcus aureus with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 0.25 mg/mL.However, no obvious inhibitory effect on Rhizopus, Aspergillus niger or Nanyang yeast was observed.

Schisandra chinensis (Turcz.) Baill；schisandrin B； free radical-scavenging activity；antimicrobial activity

TS201.2

A

1002-6630(2011)05-0079-04

2010-05-23

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAI09B04)；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)青年教師基金項目(2010)

李斌(1979—)，男，講師，博士，研究方向為天然產(chǎn)物提取及功能性食品開發(fā)。E-mail：libinsyau@163.com

*通信作者：孟憲軍(1960—)，男，教授，博士，研究方向為食品深加工及綜合利用。E-mail：mengxjsy@126.com