韓 飛，周孟良

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

過(guò)氧化氫誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的建立

韓 飛，周孟良

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

不同濃度過(guò)氧化氫作用人肝癌細(xì)胞(HepG2)4h后，用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)測(cè)定DNA損傷狀況，分光光度法測(cè)定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性，研究過(guò)氧化氫的最佳作用濃度，構(gòu)建體外氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。結(jié)果表明，過(guò)氧化氫的最佳作用濃度為100μmol/L，作用細(xì)胞的時(shí)間選擇4h，可以成功構(gòu)建以過(guò)氧化氫為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑的HepG2細(xì)胞體外氧化應(yīng)激模型。

過(guò)氧化氫；HepG2細(xì)胞；氧化應(yīng)激模型

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物而引起的細(xì)胞損傷。自由基作用于生物大分子，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致諸如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、炎癥、衰老、癌癥等的發(fā)生發(fā)展[1]。建立成功可靠的氧化應(yīng)激模型，對(duì)于揭示氧化應(yīng)激機(jī)制以及研究和篩選抗氧化藥物和功能食品都有重要意義[2]。過(guò)氧化氫是一種重要的活性氧，極易透過(guò)細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過(guò)Fenton反應(yīng)形成高活性的自由基，導(dǎo)致一系列反應(yīng)，其易于獲得，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，所以它已成為研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具[3-4]。本研究以人肝癌細(xì)胞(HepG2)為基礎(chǔ)，以過(guò)氧化氫為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑構(gòu)建體外氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。以單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)測(cè)定DNA損傷狀況以及分光光度法測(cè)定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性以摸索過(guò)氧化氫的最佳作用濃度，構(gòu)建體外氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，為后續(xù)研究篩選抗氧化劑的生物芯片實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HepG2(人肝癌細(xì)胞) 協(xié)和醫(yī)科大學(xué)。

青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、胰蛋白酶 美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；H2O2、二甲基亞砜、EDTA、正常熔點(diǎn)瓊脂糖 北京化學(xué)試劑公司；MDA測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、GSH-Px活力測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；測(cè)定與分析用水均為超純水。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；101A-3B電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司；SW-GJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；液氮罐 美國(guó)Thermo公司；3K15冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；37XB倒置顯微鏡 上海光學(xué)儀器五廠；奧林巴斯IX71熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株氏會(huì)社；PE Lambda35紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer儀器公司；BIORAD電泳儀、BIO-RAD 680酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞(HepG2)培養(yǎng)[5-7]

將HepG2細(xì)胞按5×105個(gè)/mL接種在含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10mmol/L Hepes緩沖液、2mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine)的DMEM培養(yǎng)基中(pH 7.2)，37℃、5% CO2溫育。細(xì)胞為多角形貼壁生長(zhǎng)，每2～3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為正常對(duì)照組，加入常規(guī)培養(yǎng)液；H2O2處理組，加入培養(yǎng)液和H2O2，H2O2終濃度分別為10、100、1000μmol/L。

1.2.3 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率[8]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以105個(gè)/mL密度接種于96孔板上，共設(shè)4組，每組5孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，同上加藥物處理，每孔100μL作用4h，然后每孔加入10μL 5g/L的MTT，溫育4h，去除培養(yǎng)液及MTT，每孔加入200μL二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)570nm處的吸光度。

1.2.4 單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷[9]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以105個(gè)/mL密度接種于12孔板上，共設(shè)4組，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，同上加藥物處理，每孔700μL作用4h，然后去除培養(yǎng)液，4℃ PBS洗一次，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，1000r/min離心5min后收集細(xì)胞，用磷酸緩沖液(PBS)重懸，密度為1×105個(gè)/mL。將加熱溶解的0.8%正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)冷卻至45～60℃時(shí)，取120μL鋪于磨砂載玻片上，蓋上蓋玻片，4℃凝固10min。取100μL單細(xì)胞懸液與37℃等體積1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)混勻液，鋪于第二層膠上，蓋上蓋玻片，4℃固定15min后揭去蓋玻片，將膠板浸于4℃裂解液(含2.5mol/L NaCl、100mmol/L Na2EDTA、10mmol/L Tris，pH10.0，臨用前加10%的DMSO，1%的TritonX-100)中裂解1.5h。取出載玻片用蒸餾水輕柔漂洗2次，以免瓊脂糖脫落，然后將膠板浸于4℃電泳緩沖液(1mmol/L Na2EDTA、300mmol/L NaOH，pH13.0)解螺旋20min，電泳(17V，200mA)20min。電泳結(jié)束后，膠板用中和緩沖液(0.4mol/L Tris，pH7.5)中和兩次，每次10min，中和完全后用2μg/mL的EB 50μL染色5min，蒸餾水脫色10min。以上操作均在4℃暗處進(jìn)行[10-11]。

熒光顯微鏡10×目鏡、20×物鏡下觀察結(jié)果(激發(fā)光波長(zhǎng)510～560nm)及拍照。每組隨機(jī)選擇20個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用CASP軟件測(cè)量照片中尾矩(從彗星頭的右邊界到彗星尾部末端的距離與尾部DNA含量的乘積)和Olive尾矩(從頭光密度重心到尾光密度重心的距離與尾部DNA含量的乘積)這兩個(gè)指標(biāo)，以反映細(xì)胞DNA的損傷程度。

1.2.5 MDA、SOD、GSH-Px的測(cè)定

取藥物作用的細(xì)胞，用PBS洗1遍，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化，制成細(xì)胞懸液，4000r/min離心5min收集細(xì)胞，用PBS洗一遍，加入細(xì)胞裂解液(150mmol/L NaCl、150mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、1% Triton X-100，pH8.0)使細(xì)胞裂解[12-13]，于4℃離心1h，以上清液作為樣本，參照南京建成生物工程研究所提供的相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD、GSH-Px活性。SOD活力單位定義為每毫克組織蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD酶活力為一個(gè)酶活力單位(U) ；GSH-Px活力單位定義為每毫克蛋白質(zhì)每分鐘扣除非酶反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1μmol/L為一個(gè)活力單位(U)。蛋白質(zhì)定量采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，兩組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s的形式表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化氫對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的H2O2作用于HepG2細(xì)胞4h后，低濃度10、100μmol/L H2O2作用細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組相比沒(méi)有顯著變化，500、1000μmol/L H2O2作用細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組相比顯著降低，且隨著H2O2濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低(圖1)。

圖1 H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響(±s，n=5)Fig.1 Effect of H2O2 on HepG2 cell survival (±s, n = 5)

2.2 過(guò)氧化氫對(duì)肝癌細(xì)胞DNA損傷的影響

不同濃度的H2O2作用于HepG2細(xì)胞4h后，與正常對(duì)照組比較，10μmol/L H2O2作用細(xì)胞，尾矩和Olive尾矩雖有增加，但無(wú)顯著差異，從圖中也未見(jiàn)其尾巴有顯著增長(zhǎng)，100、1000μmol/L H2O2作用細(xì)胞，尾矩和Olive尾矩顯著增加，尾巴也出現(xiàn)顯著性增長(zhǎng)，并隨著H2O2濃度的升高，尾矩和Olive尾矩也同時(shí)增長(zhǎng)(圖2，表1)。Scolastici等[14]報(bào)道100μmol/L H2O2作用HepG2細(xì)胞DNA也出現(xiàn)顯著性損傷，然而細(xì)胞存活率沒(méi)有產(chǎn)生變化。

表1 H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞DNA損傷的影響(±s，n=20)Table 1 Effect of H2O2 on DNA damage in HepG2 cell (±s, n = 20)

表1 H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞DNA損傷的影響(±s，n=20)Table 1 Effect of H2O2 on DNA damage in HepG2 cell (±s, n = 20)

注：*.與正常對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.05)。

組別 尾矩 Olive尾矩正常對(duì)照組 1.60±2.20 2.31±2.27 10μmol/L H2O2組 3.03±2.45 3.74±2.52 100μmol/L H2O2組 27.08±8.90* 17.50±5.37*1000μmol/L H2O2組 35.40±7.35* 31.12±6.45*

圖2 熒光顯微鏡下DNA形態(tài)(×200)Fig.2 DNA observed under fluorescence microscope (×200)

2.3 過(guò)氧化氫對(duì)肝癌細(xì)胞MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影響

表2 H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞MDA含量、SOD及GSH-Px活性的影響(x± s，n=3)Table 2 Effect of H2O2 on MDA content, SOD and GSH-Px activities in HepG2 cell (x± s，n=3)

不同濃度的H2O2作用于HepG2細(xì)胞4h后，與正常對(duì)照組比較，10μmol/L H2O2作用細(xì)胞，MDA含量和SOD、GSH-Px活性都未發(fā)生顯著變化，100、1000μmol/L H2O2作用細(xì)胞，其值都發(fā)生了顯著變化。隨著H2O2濃度的升高，MDA含量也同時(shí)升高，而SOD和GSH-Px活性卻在同時(shí)降低(表2)。

3 討 論

一個(gè)好的模型必須具備特異性、模擬性和可控性。本實(shí)驗(yàn)的目的是構(gòu)建氧化應(yīng)激的細(xì)胞模型，該模型在適宜濃度的H2O2誘導(dǎo)下，細(xì)胞的DNA被外泄、損傷，相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)被損傷，但是這種損傷不會(huì)造成細(xì)胞死亡，而且在適宜的抗氧化劑的作用下，這些損傷還有可能被修復(fù)。由于4h是測(cè)量相關(guān)基因產(chǎn)生表達(dá)變化的最小共有間隔[15]，同時(shí)考慮到長(zhǎng)時(shí)間的氧化作用會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆損傷甚至死亡[9]，因此過(guò)氧化氫作用細(xì)胞的時(shí)間選擇為4h。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，當(dāng)H2O2作用HepG2細(xì)胞濃度為100 μmol/L，作用時(shí)間為4h時(shí)，細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著降低，而細(xì)胞DNA出現(xiàn)了顯著性損傷，尾矩和Olive尾矩顯著增加，尾巴也出現(xiàn)顯著性增長(zhǎng)，且MDA含量、SOD、GSH-Px活性都發(fā)生了顯著變化，說(shuō)明在此濃度下，HepG2細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)DAN已外泄，且細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)和酶系都發(fā)生了顯著變化，但是這種損傷不會(huì)造成細(xì)胞死亡，因此過(guò)氧化氫的最佳作用濃度選為100 μmol/L。Farombi等[9]用同樣濃度的過(guò)氧化氫(100 μmol/L)處理肝細(xì)胞，利用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)觀察到DNA斷裂水平的增多，從DNA水平證明了過(guò)氧化氫氧化損傷模型可以提供一個(gè)較理想的抗氧化實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。鄭延松等[3]用低濃度過(guò)氧化氫(100 μmol/L)成功建立了心肌細(xì)胞氧化損傷模型，且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低濃度的過(guò)氧化氫隨著時(shí)間的延長(zhǎng)可以表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞損傷效應(yīng)，先是細(xì)胞功能的改變，損傷積累到一定程度就觸發(fā)了細(xì)胞的器質(zhì)性損害和不可逆損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)氧化氫作用濃度為100 μmol/L，作用時(shí)間4h，可以成功構(gòu)建以過(guò)氧化氫為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑的HepG2細(xì)胞體外氧化應(yīng)激模型。該模型的建立為揭示氧化應(yīng)激機(jī)制以及研究和篩選抗氧化藥物和功能食品奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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An Experimental HepG2 Cell Model of Hydrogen Peroxide Induced DNA Oxidative Injury

HAN Fei，ZHOU Meng-liang
(Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

The oxidative effect of 4 h exposure to H2O2 at different concentrations on HepG2 cells was measured by determining DNA damage by single cell gel electrophoresis technique and assaying MDA content and the activities of SOD and GSH-Px in HepG2 cells. An experimental model of oxidative stress was established based on the optimal concentration of H2O2. The results showed that the optimal H2O2 concentration determined was 100μmol/L and construction of the HepG2 cell model of oxidative injury came to success after 4 h treatment with H2O2 at this concentration.

H2O2；HepG2 cell；oxidative stress model

Q505

A

1002-6630(2011)05-0055-03

2010-07-12

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(ZX0706)

韓飛(1973—)，女，副研究員，博士，主要從事糧油(食品)營(yíng)養(yǎng)與功能研究。E-mail：hf@chinagrain.org