南京市江寧醫(yī)院（211100）陶琴

蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院（215006）楊俊華

附圖 與HCM相關(guān)的TNNI3突變位點(diǎn)分布圖

自1997年Kimura等首次發(fā)現(xiàn)TNNI3基因突變可導(dǎo)致HCM[1]，至今已發(fā)現(xiàn)20多種TNNI3突變[2]，除R21C、P82S突變分別位于第3號(hào)及第5號(hào)外顯子外，其余大部分位于第7、第8號(hào)外顯子，如附圖。本研究對(duì)14例家族性HCM患者第3、5、7、8號(hào)外顯子進(jìn)行掃描，旨在發(fā)現(xiàn)在這一范圍上有無基因突變位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 無血緣關(guān)系的肥厚型心肌病患者14例，均為2002年至2006年江蘇地區(qū)門診及住院的HCM患者，年齡16～62歲，其中男性6例，女性8例，每例患者其家族中至少有兩人發(fā)病。臨床資料包括體檢、心電圖、二維及多普勒超聲心動(dòng)圖檢查。HCM患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：超聲心動(dòng)圖檢查室間隔或心室壁厚度≥13mm，排除高血壓、主動(dòng)脈瓣狹窄等其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾?。ㄔ\斷依據(jù)WHO/ISFC1996年公布標(biāo)準(zhǔn)）。FHCM診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者(先證者)家族中有多人發(fā)病，并符合常染色體顯性遺傳特點(diǎn)：①患者雙親中一方患病，致病基因由患病親代傳來；②患者同胞中1/2將會(huì)發(fā)病，而且男女患病機(jī)會(huì)均等；③患者子代中有1/2將患??；④可幾代連續(xù)傳遞。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集HCM患者及正常對(duì)照組的外周靜脈血2ml，枸櫞酸鉀抗凝，采用QIAGEN公司試劑盒，從白細(xì)胞中提取其基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增基因組DNA根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)TNNI3 基因第3、5、7、8號(hào)外顯子含側(cè)翼內(nèi)含子序列的引物（附表1）。由上海生工（sangon）生物技術(shù)公司合成。PCR擴(kuò)增體系：50μl反應(yīng)體系含基因組DNA500ng，上下游引物各10pmol，10xbuffer5μl，dNTP200μmol，TaqDNA聚合酶2.5U（由上海生工生物技術(shù)公司提供）。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃，5min；變性94℃，30s；退火（見附表）30s，延伸72℃，45s；共34個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃，10min。PCR儀為東勝創(chuàng)新生物科技公司的PTC-200。

1.2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序并檢測(cè)突變位點(diǎn) 按雙脫氧末端終止法進(jìn)行測(cè)序（美國(guó)ABI公司3730XL自動(dòng)測(cè)序儀），測(cè)序引物與PCR引物相同，TNNI3 基因7號(hào)外顯子的目的片段大小約177bp。運(yùn)用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq程序來分析測(cè)序結(jié)果，檢測(cè)是否具有突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 心肌肌鈣蛋白I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂電泳結(jié)果 4對(duì)引物設(shè)計(jì)合成后，取正常人（門診體檢合格）基因組DNA，PCR分別擴(kuò)增心肌肌鈣蛋白I基因3、5、7、8號(hào)外顯子，15g/L瓊脂糖電泳產(chǎn)物，可見堿基數(shù)目相當(dāng)?shù)碾娪緱l帶，同時(shí)送上海英駿公司測(cè)序，結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增條帶序列與genebank人心肌肌鈣蛋白I基因登錄標(biāo)準(zhǔn)序列（X90780）完全吻合，分別擴(kuò)增14例家族性HCM患者TNNI3基因3、5、7、8號(hào)外顯子。

2.2 測(cè)序結(jié)果 14例先證者TNNI3基因3、5、7、8號(hào)外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈構(gòu)型多態(tài)性及測(cè)序結(jié)果顯示，未見國(guó)外報(bào)道的20余種心肌肌鈣蛋白I基因突變類型。僅在1個(gè)標(biāo)本7號(hào)外顯子發(fā)現(xiàn)179位密碼子GAGGAA的多態(tài)性，未引起氨基酸置換，國(guó)外[3]、國(guó)內(nèi)均已見報(bào)道[4]。

3 討論

研究的14例家族型肥厚性心肌病先證者，均已在β-肌球蛋白重鏈基因（β-MyHC）3-26號(hào)外顯子、肌球蛋白結(jié)合蛋白C基因（MYBPC3）2-35號(hào)外顯子以及肌鈣蛋白T基因（TNNT2）2-16號(hào)外顯子進(jìn)行突變基因篩查，未見異常。本次研究中，對(duì)該14例先證者的心肌肌鈣蛋白I基因第3、5、7、8號(hào)外顯子進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的該基因上的20余種突變類型。

分析原因可能如下：①心肌肌鈣蛋白I基因突變可能在我國(guó)肥厚型心肌病患者中發(fā)生率不高，未達(dá)到國(guó)外報(bào)道的水平。②突變可能主要分布在其它未檢測(cè)的基因外顯子上，而不是3、5、7、8號(hào)外顯子。③納入人群樣本量小，進(jìn)一步研究需加大樣本累積。而在TNNI3基因第7號(hào)外顯子見179位密碼子GAG-GAA多態(tài)性（均編碼谷氨酸）未引起氨基酸置換，在正常人群中亦可見，無特別意義。

本研究可能提示中國(guó)漢族人群家族性肥厚型心肌病患者致病基因分布特點(diǎn)與國(guó)外人群不同[5～7]，肌鈣蛋白I基因突變?cè)谥袊?guó)漢族家族性肥厚型心肌病患者中發(fā)病率偏低。

4 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)HCM基因突變研究的深入，已有越來越多的突變基因被發(fā)現(xiàn)，關(guān)于基因型與表型的關(guān)系的闡述也越來越明了。但HCM作為一種基因多態(tài)性疾病，其致病基因及突變類型復(fù)雜多變，致病基因遠(yuǎn)未被完全揭示，影響其預(yù)后的因素也遠(yuǎn)未被闡明，對(duì)臨床工作的指導(dǎo)作用還很局限。因此還需要進(jìn)行更多的工作來揭示導(dǎo)致HCM的突變基因譜，揭示基因突變與臨床表現(xiàn)及預(yù)后的關(guān)系，為基因治療打下基礎(chǔ)。

附表 TNNI3基因各外顯子PCR擴(kuò)增引物及退火溫度