南京市江寧醫(yī)院（211100）陶琴

蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院（215006）楊俊華

附圖 與HCM相關(guān)的TNNI3突變位點分布圖

自1997年Kimura等首次發(fā)現(xiàn)TNNI3基因突變可導(dǎo)致HCM[1]，至今已發(fā)現(xiàn)20多種TNNI3突變[2]，除R21C、P82S突變分別位于第3號及第5號外顯子外，其余大部分位于第7、第8號外顯子，如附圖。本研究對14例家族性HCM患者第3、5、7、8號外顯子進行掃描，旨在發(fā)現(xiàn)在這一范圍上有無基因突變位點。

1 材料與方法

1.1 材料 無血緣關(guān)系的肥厚型心肌病患者14例，均為2002年至2006年江蘇地區(qū)門診及住院的HCM患者，年齡16～62歲，其中男性6例，女性8例，每例患者其家族中至少有兩人發(fā)病。臨床資料包括體檢、心電圖、二維及多普勒超聲心動圖檢查。HCM患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：超聲心動圖檢查室間隔或心室壁厚度≥13mm，排除高血壓、主動脈瓣狹窄等其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾病（診斷依據(jù)WHO/ISFC1996年公布標(biāo)準(zhǔn)）。FHCM診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者(先證者)家族中有多人發(fā)病，并符合常染色體顯性遺傳特點：①患者雙親中一方患病，致病基因由患病親代傳來；②患者同胞中1/2將會發(fā)病，而且男女患病機會均等；③患者子代中有1/2將患?。虎芸蓭状B續(xù)傳遞。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集HCM患者及正常對照組的外周靜脈血2ml，枸櫞酸鉀抗凝，采用QIAGEN公司試劑盒，從白細胞中提取其基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增基因組DNA根據(jù)文獻報道設(shè)計TNNI3 基因第3、5、7、8號外顯子含側(cè)翼內(nèi)含子序列的引物（附表1）。由上海生工（sangon）生物技術(shù)公司合成。PCR擴增體系：50μl反應(yīng)體系含基因組DNA500ng，上下游引物各10pmol，10xbuffer5μl，dNTP200μmol，TaqDNA聚合酶2.5U（由上海生工生物技術(shù)公司提供）。PCR擴增條件：預(yù)變性94℃，5min；變性94℃，30s；退火（見附表）30s，延伸72℃，45s；共34個循環(huán)；最后延伸72℃，10min。PCR儀為東勝創(chuàng)新生物科技公司的PTC-200。

1.2.3 PCR產(chǎn)物測序并檢測突變位點 按雙脫氧末端終止法進行測序（美國ABI公司3730XL自動測序儀），測序引物與PCR引物相同，TNNI3 基因7號外顯子的目的片段大小約177bp。運用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq程序來分析測序結(jié)果，檢測是否具有突變位點。

2 結(jié)果

2.1 心肌肌鈣蛋白I的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂電泳結(jié)果 4對引物設(shè)計合成后，取正常人（門診體檢合格）基因組DNA，PCR分別擴增心肌肌鈣蛋白I基因3、5、7、8號外顯子，15g/L瓊脂糖電泳產(chǎn)物，可見堿基數(shù)目相當(dāng)?shù)碾娪緱l帶，同時送上海英駿公司測序，結(jié)果證實擴增條帶序列與genebank人心肌肌鈣蛋白I基因登錄標(biāo)準(zhǔn)序列（X90780）完全吻合，分別擴增14例家族性HCM患者TNNI3基因3、5、7、8號外顯子。

2.2 測序結(jié)果 14例先證者TNNI3基因3、5、7、8號外顯子PCR擴增產(chǎn)物單鏈構(gòu)型多態(tài)性及測序結(jié)果顯示，未見國外報道的20余種心肌肌鈣蛋白I基因突變類型。僅在1個標(biāo)本7號外顯子發(fā)現(xiàn)179位密碼子GAGGAA的多態(tài)性，未引起氨基酸置換，國外[3]、國內(nèi)均已見報道[4]。

3 討論

研究的14例家族型肥厚性心肌病先證者，均已在β-肌球蛋白重鏈基因（β-MyHC）3-26號外顯子、肌球蛋白結(jié)合蛋白C基因（MYBPC3）2-35號外顯子以及肌鈣蛋白T基因（TNNT2）2-16號外顯子進行突變基因篩查，未見異常。本次研究中，對該14例先證者的心肌肌鈣蛋白I基因第3、5、7、8號外顯子進行檢測，未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外已報道的該基因上的20余種突變類型。

分析原因可能如下：①心肌肌鈣蛋白I基因突變可能在我國肥厚型心肌病患者中發(fā)生率不高，未達到國外報道的水平。②突變可能主要分布在其它未檢測的基因外顯子上，而不是3、5、7、8號外顯子。③納入人群樣本量小，進一步研究需加大樣本累積。而在TNNI3基因第7號外顯子見179位密碼子GAG-GAA多態(tài)性（均編碼谷氨酸）未引起氨基酸置換，在正常人群中亦可見，無特別意義。

本研究可能提示中國漢族人群家族性肥厚型心肌病患者致病基因分布特點與國外人群不同[5～7]，肌鈣蛋白I基因突變在中國漢族家族性肥厚型心肌病患者中發(fā)病率偏低。

4 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步和對HCM基因突變研究的深入，已有越來越多的突變基因被發(fā)現(xiàn)，關(guān)于基因型與表型的關(guān)系的闡述也越來越明了。但HCM作為一種基因多態(tài)性疾病，其致病基因及突變類型復(fù)雜多變，致病基因遠未被完全揭示，影響其預(yù)后的因素也遠未被闡明，對臨床工作的指導(dǎo)作用還很局限。因此還需要進行更多的工作來揭示導(dǎo)致HCM的突變基因譜，揭示基因突變與臨床表現(xiàn)及預(yù)后的關(guān)系，為基因治療打下基礎(chǔ)。

附表 TNNI3基因各外顯子PCR擴增引物及退火溫度