劉 敏,王俊賢,李玉桑,宋一倩,藍麗萍,唐和斌

(中南民族大學藥學院,武漢430074)

復方三芪提取物對NMDA致大鼠視網膜損傷的保護作用

劉 敏,王俊賢,李玉桑,宋一倩,藍麗萍,唐和斌＊

(中南民族大學藥學院,武漢430074)

目的:研究復方三芪提取物對由N-甲基-D天門冬氨酸(NMDA)誘導的大鼠視網膜損傷模型的保護作用.方法:20只SD大鼠隨機分為5組:正常對照組、模型組、復方三芪提取物低、中、高劑量組.模型組和給藥組大鼠于右眼玻璃體內注射2μL 40 nmol·L-1NMDA,制備視網膜神經元損傷模型.給藥組在NMDA注射前7 d起給予復方三芪提取物灌胃(3.903,7.805,15.61 g·kg-1.B.W.);正常對照組和模型組則給予等劑量的生理鹽水灌胃.注射NMDA 7 d后靜脈取血,測定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,取眼球組織,切片HE染色,觀察視網膜厚度,并對視網膜視神經節(jié)細胞層(RGCL)神經元進行計數.結果:模型組大鼠RGCL神經元個數為正常組大鼠的51±6%.同模型組相比,復方三芪提取物(3.903,7.805,15.61 g·kg-1.B.W.)能劑量依賴性地增加RGCL神經元個數(P＜0.05),依次為正常組的69±6%,89±7%,103±7%.復方三芪提取物(7.805 g·kg-1.B.W.)顯著提高大鼠血清SOD活性并降低MDA含量(P＜0.001).結論:復方三芪提取物能抑制NMDA誘導的視網膜脂質過氧化,并能阻止大鼠視網膜神經元進行性丟失,對NMDA誘導損傷的大鼠視網膜有修復作用.提示復方三芪提取物可能具有促進神經元的再生作用.

復方三芪提取物;視網膜;N-甲基-D天門冬氨酸;視神經保護

視網膜疾病對視力的危害日益嚴重.約有一半患者喪失視力,是臨床亟待解決的問題.在某些眼病中,視神經元的損傷主要是由于興奮性氨基酸受體如N-甲基-D天門冬氨酸(NMDA)受體被過激活[1-2],導致大量過氧化脂質產物如丙二醛(MDA)生成,超氧化物歧化酶(SOD)活性抑制,同時誘導視網膜視神經節(jié)細胞層 (RGCL)神經元凋亡[3].RGCL神經元在視神經損傷時的逆行性退變、死亡是導致視功能不可逆性損害的主要原因[4].以往的研究認為成年哺乳動物的視神經損傷后不能再生,然而2007年O sakada等發(fā)現神經元在體內外均可被誘導再生[5].然而迄今為止尚無肯定療效的視網膜疾病治療藥物.復方三芪提取物中的三七,黃芪[6-7]能抗氧化,調節(jié)微循環(huán),對視網膜損傷具有潛在的治療作用.麥冬消炎抗菌,黃精可明目,用于輔助治療.我們在中山大學中山眼科中心經驗方“益氣明目口服液”[8-9]的基礎上,運用現代藥理學方法對組方藥物進行提取、優(yōu)化,研制出復方三芪提取物.本實驗采用NMDA誘導建立大鼠視網膜神經元損傷模型,對RGCL神經元進行計數,觀察復方三芪提取物對大鼠視網膜神經元損傷的保護作用,并檢測大鼠血清中SOD的活性和MDA的含量,探討其作用原理.

1 實驗材料

1.1 動物及分組

Sprague-Daw ley健康大鼠,20只,雌雄各半,體重170～190 g,由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心提供.隨機分為5組:正常對照組、模型組、復方三芪提取物低、中、高劑量組,每組4只.飼養(yǎng)條件為:飼養(yǎng)于48 cm×35 cm×24 cm的鼠籠中,4只/籠;12 h交替照明(從早上7時開始照明),室溫保持在25±1℃,濕度為60%～70%,自由獲取水和食物.所有的動物實驗和處理均遵照"The Guidelines for the Care and U se of L aboratory A nimals".

1.2 實驗儀器及試劑

切片機(德國,L eica Rm 2265);石蠟包埋機(德國,L eica EG0050H);顯微鏡系統(tǒng)(日本,N ikon Eclipse T i);高速臺式離心機(上海,安亭TGL-20B).

NMDA(sigma公司,美國);戊巴比妥鈉(merk,德國);硫酸阿托品(安陽九州藥業(yè),批號0906041);地塞米松磷酸鈉滴眼液(武漢五景藥業(yè)有限公司,批號09030101);諾氟沙星滴眼液(武漢五景藥業(yè)有限公司,批號09040701);氯化鈉(sigma公司,美國);SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號20100116);MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號20100116);福爾馬林(sigma公司,美國);實驗用水為超純水.

復方三芪提取物的制備:復方包含黃芪(內蒙古,批號101126),三七(云南,批號091101)等8味藥,其中黃芪等4味中藥采用水提醇沉法,三七等4味中藥采用70%乙醇提取3次,濃縮合并提取物,干燥備用.

2 方法

2.1 給藥

動物適應環(huán)境一周后,分別給予復方三芪提取物低、中、高劑量組大鼠灌胃復方三芪提取物,劑量分別為3.903,7.805和15.61 g·kg-1(生藥總量換算),正常對照組和模型組則給予等劑量的生理鹽水灌胃.每天灌胃1次,給藥時間為14 d.

2.2 造模及處理

給藥7 d后制備大鼠視網膜神經元損傷模型.各組大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(10 mL·kg-1.B.W.)麻醉,雙眼滴入硫酸阿托品擴瞳,根據Kawasaki等采用的方法略為改進[10-18],具體方法為:采用尖頭微量注射器于模型組和復方三芪提取物低、中、高劑量組的大鼠右眼玻璃體內注射NMDA(2 μL 40 nmol·L-1).手術后,繼續(xù)飼養(yǎng)并給藥,每天采用地塞米松磷酸鈉滴眼液和諾氟沙星滴眼液處理(1次/d),以預防感染.

NMDA處理后第7 d處死各組大鼠.靜脈取血,采用試劑盒提供的相應方法測定血清樣本中的SOD活性和MDA的含量.摘取雙眼眼球組織浸入福爾馬林固定液中,24 h后用流水沖洗3 h,然后梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片和HE染色處理,每只大鼠任意選取5張切片,每個切片隨機選取3個視野,于顯微鏡下觀察視網膜厚度并對RGCL神經元進行計數.計數方法:同一倍率下,記錄視野中神經節(jié)細胞層長為160μm(長度以標尺為準,平行于神經節(jié)細胞層方向)的任意區(qū)域內神經元個數,取平均值.

2.3 數據統(tǒng)計與分析方法

采用了SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件處理,進行t-檢驗.數據以±SD表示.P＜0.05表示有顯著差異.

3 結果

3.1 HE染色切片RGCL神經元計數

如圖1可見,同正常組相比(圖1.A),模型組的大鼠RGCL神經元數量顯著減少(圖1.B).計數表明:模型組RGCL神經元個數為正常組的51%±6%.同模型組相比,復方三芪提取物(3.903,7.805,15.61 g·kg-1)劑量依賴性地增加RGCL神經元個數(P＜0.05),計數結果顯示:同一倍率下單位區(qū)域內RGCL神經元數目依次為正常組的69%±6%,89%±7%,103%±7%(表1).模型組的大鼠視網膜神經內核層細胞(組織中間致密層)亦有丟失,外核層(組織下方致密層)出現空泡(圖1.B).復方三芪提取物(3.903,7.805,15.61 g·kg-1)明顯改善各層細胞丟失(圖1.C-E).

圖1 復方三芪提取物對大鼠視網膜損傷的影響Fig.1 Effect of Compound Sanqi Extract(CSE)on retina damage in rats

表1 復方三芪提取物對大鼠視網膜視神經節(jié)層神經元數目的影響Tab.1 Effect of CSE on the number of RGCL neurons in rats

3.2 SOD活性和MDA含量

上述RGCL神經元的計數結果表明復方三芪提取物(3.903,7.805,15.61 g·kg-1)劑量依賴地增加RGCL神經元個數.為了研究復方三芪提取物是否可以促進機體的損傷修復,我們選定療效明顯的復方三芪提取物(7.805 g·kg-1)中劑量組為檢測對象,測定了該組大鼠血清中的SOD活性及MDA含量,并同正常組和模型組相比較,明確復方三芪提取物的全身抗氧化作用.結果顯示:與正常對照組相比,模型組的大鼠血清中SOD活性明顯降低(P＜0.05);復方三芪提取物(7.805 g·kg-1)具有增加SOD活性趨勢.同正常對照組相比,模型組的大鼠血清中MDA含量顯著升高(P＜0.001);復方三芪提取物組(7.805 g·kg-1)的大鼠MDA含量均顯著降低.復方三芪提取物組(7.805 g·kg-1)的大鼠血清SOD/MDA值明顯地高于模型組(P＜0.001),結果見表2.

表2 復方三芪提取物對大鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響Tab.2 Effect of CSE on SOD activity andMDA level of rat serum

4 討論

氧自由基廣泛存在于各種生物體中,性質活潑,可與生物大分子,特別是細胞膜上的不飽和脂肪酸結合,形成脂質過氧化物,破壞生物膜.SOD是生物體內專一清除超氧陰離子自由基(O-2)的特異性抗氧化酶,可有效清除體內過多的O-2,以保持O-2的動態(tài)平衡,阻斷由過多O-2所引起的一系列氧自由基病理反應[10].MDA是超氧化物陰離子自由基作用于生物膜磷脂結構不飽和脂肪酸所形成的終產物之一,其產生的量與氧自由基的量相平衡,其含量多少可間接反應自由基對組織細胞損傷強度,因而測定MDA的量可反映氧自由基的含量,在一定程度上可反映組織細胞損傷的程度.同時,MDA為一種重要的大分子交聯劑,能交聯蛋白質與核酸,使DNA發(fā)生突變,影響信息傳遞、轉錄和復制,從而導致蛋白質合成能力的下降或合成蛋白質功能紊亂,同時使自由基清除劑的關鍵酶SOD生成減少、活性降低,從而導致視網膜組織損傷[11].

其導致的視網膜內層毒性主要體現在RGCL神經元數量減少及視網膜變薄[12-16].視神經由RGCL神經元的軸突匯集組成,RGCL神經元與軸突數目間存在對應關系.通過對RGCL神經元的計數分析,可以判斷NDMA所致損傷的嚴重程度[17-18].

本研究通過對血清中的SOD活性和MDA含量的分析發(fā)現,復方三芪提取物在大鼠體內減少過氧化產物并提高抗氧化酶活性,有效清除體內的自由基,阻止自由基對視網膜細胞組織的氧化損傷,維持的機體正常代謝.并且視網膜的HE染色結果顯示:給予NMDA損傷后,大鼠RGCL神經元數目嚴重減少,內核層細胞丟失,在外核層出現大面積空泡.同NMDA誘導視網膜損傷模型大鼠相比,復方三芪提取物的給藥處理能有效地阻止NMDA誘發(fā)的大鼠RGCL神經元數量減少,使視網膜內核層及外核層細胞恢復或保持正常水平.說明復方三芪提取物能通過增強機體抗氧化能力,對NMDA損傷的大鼠視網膜神經元進行修復,有效地保護了視網膜組織.本研究中,復方三芪提取物對視網膜損傷的改善很可能是發(fā)揮多靶點的整體協同效應,阻止視神經節(jié)細胞的病理進行性丟失,促進神經節(jié)細胞再生.其保護視網膜神經元機制有待于更深入的研究.

[1] Kow luru R A,Engerman R L,Case G L,et al.Retinal glutamate in diabetes and effect of antioxidants[J].N eurochem Int,2001,38(5):385-390.

[2] M oncaster J A,W alsh D T,Gentleman S M,et al.Ergothioneine treatment protects neurons against N-methyl-daspartate excitotoxicity in an in vivo rat retinal model[J].N euroscience L etters,2002,328(11):55-59.

[3] 林 丁,陳 琛.青光眼的視網膜神經節(jié)細胞損傷及其保護[J].中華眼科雜志,2005,41(12):1144-1148.

[4] 黃 蔚,王 琳,惠延年,等.腦源性神經營養(yǎng)因子對大鼠視網膜節(jié)細胞損傷的保護作用[J].眼科學報,2000,16(4):231-234.

[5] O sakada F,Ooto S,A kagi T,et al.W nt Signaling PromotesRegeneration in the RetinaofA dult M ammals[J].The JournalofN euroscience,2007,27(15):4210-4219.

[6] 姚茹冰,趙智明,蔡 輝.活血化瘀中藥三七抗炎及免疫調節(jié)作用研究進展[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2009,7(6):720-721.

[7] 楊長春,韓 盈,張安生,等.黃芪、當歸及川芎嗪等活血化瘀藥對肝癌細胞株HepG2纖溶酶原激活物抑制劑1表達的影響[J].中國臨床康復,2005,9(19):210-

212.

[8] 唐細蘭,吳 偉,葉成添,等.益氣明目口服液對光損傷模型大鼠的療效觀察[J].眼科學報,2007,23(1):25-30.

[9] 唐細蘭,王延東,黃楚龍,等.益氣明目口服液對缺血再灌注損傷大鼠視網膜的保護作用,2008,31(1):91-94.

[10] 汪云春,付鐵娟,趙智宇,等.亞低溫對大鼠局灶性腦缺血氧自由基和一氧化氮的影響[J].中國老年學雜志,2007,5(27):991-993.

[11] Slater T F,Cheeseman K H,Benedetto C,et a1.L iver follow ing partial hepatectomy:changes inlipid perxidation and general biochem ical aspects[J].Biochem J,1990,265(1):51-59.

[12] L am T T,A bler A S,Kwong J M K,et a1.NM ethyl-D-A spartate(NMDA)-induced apoptosis in rat retina[J].Invest OphthalmolV is Sci,1999,40(10):2391-2397.

[13] D reyer E B,Zurkow ski D,Schumer R A.et a1.

Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys w ith glaucoma[J].A rch Ophthalmol,1996,114(3):299-305.

[14] KawasakiA,Han M H,W ei J Y,et a1.Protective efect of arachidonic acid on glutamate neurotoxicity in rat retinal ganglion cells[J].Invest Ophthalmol V is Sci,2002,43(6):1835-1842.

[15] Siliprandi R,Canella R,Carm ignoto G,et a1.N-methyl-D-asparate-induced neurotoxicity in the adult rat retina[J].V isualN eurosci,1992,8(6):567-573.

[16] 石晶明,蔣幼芹,劉旭陽.N-甲基D-天門冬氨酸對大鼠視網膜神經節(jié)細胞層神經元的損傷作用[J].眼科研究,2003,21(5):471-474.

[17] 石晶明,蔣幼芹,劉旭陽.N-甲基-D-天門冬氨酸對大鼠視網膜損傷的形態(tài)學觀察[J].中南大學學報:醫(yī)學版,2004,29(3):287-291.

[18] Shi J M,Jiang Y Q,L iu X Y.N europrotective effects of Erigeron Breviscapus(vant)Hand-M azz on NMDA-induced retinal neuron injury in the rats[J]. International Journal of Ophthalmology,2005,5(5):859-863.

Neuroprotective Effect of Compound Sanqi Extract on Rat Retinal Damage Induced by N-M ethyl-D-Aspartate

L iu M in,W ang J unx ian,L i Yusang,S ong Y iqian,L an L ip ing,T ang H ebin
(College of Pharmacy,South-centralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

W e investigated the neuroprotective effect of Compound Sanqi Extract(CSE)using a rat model of retinal damage induced by N-methyl-D-aspartate(NMDA)in the present study.Twenty Sprague-Daw ley rats were divided into five groups:Control group,NMDA group and three CSE groups.The rats in NMDA group and CSE groups received intravitreal injection of NMDA (2 μL 40 nmol·L-1).Rats in CSE groups were orally given different dosages of CSE(3.903,7.805 and 15.61 g·kg-1.B.W.)seven days before NMDA treatment.Rats in the control andNMDA group received oral saline.Results showed that the percentage of neuron numbers in retinal ganglion cell layer(RGCL)greatly increased in a dose-dependent manner(69±6%,89± 7%and 103±7%of control)after the seven days treatment w ith CSE as compared w ith NMDA group(51±6%of control,P＜0.05).In addition,the treatment of ratsw ith oral adm inistration of 7.805 g·kg-1CSE for seven days significantly increased superoxide dismutase(SOD)activity and decreased malondialdehyde(MDA)level in the serum as compared w ith NMDA group(P＜0.001).These findings indicated that CSE can reduce the NMDA-induced lipid peroxidation of rat retina by improving SOD activity and inhibitingMDA production,and which may stop the loss of retina ganglion cells and repair the damaged retina.

Compound Sanqi Extract;Retina;NMDA;Retinal neuron protection

R966

A

1672-4321(2011)01-0054-05

2011-01-22 ＊通訊作者 唐和斌(1970-),男,教授,博士,研究方向:藥理學,E-mail:hbtang2006@yahoo.cn

劉 敏(1983-),女,講師,博士,研究方向:神經藥理學,E-mail:lium in831016@tom.com

國家自然科學基金資助項目(81070887);中南民族大學基本科研業(yè)務費專項資金項目(CZQ 10011);中南民族大學科學研究基金(XTZ10001)