李步海,劉宇飛,孫小梅,王 獻(xiàn)

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430074)

巴氯芬與胃蛋白酶相互作用的光譜研究

李步海,劉宇飛,孫小梅,王 獻(xiàn)

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430074)

采用熒光光譜法和紫外可見(jiàn)吸收光譜法研究了巴氯芬與胃蛋白酶的結(jié)合.觀測(cè)到巴氯芬使胃蛋白酶的最大紫外吸收峰藍(lán)移.由Stern-Volmer方程求得其熒光猝滅類(lèi)型為靜態(tài)猝滅,求出結(jié)合常數(shù),由熱力學(xué)參數(shù)判斷其作用力主要為疏水作用.根據(jù)非輻射能量轉(zhuǎn)移理論,胃蛋白酶與巴氯芬之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移,從而使胃蛋白酶發(fā)生了熒光猝滅.用紅外光譜法研究了巴氯芬對(duì)胃蛋白酶的影響,結(jié)果表明:巴氯芬改變了胃蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu).

巴氯芬;胃蛋白酶;靜態(tài)猝滅;光譜法

巴氯芬(baclofen,4-氨基-3(4-氯苯)-丁酸),是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的主要抑制劑[1],通過(guò)GABAA,GABAB,和GABAC三種不同類(lèi)型的受體執(zhí)行其生理功能[2].主要用于骨骼肌松馳,神經(jīng)性痙攣如多重硬化及外傷等.

胃蛋白酶(pepsin),長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是胃部疾病的攻擊因子之一[3].藥物分子進(jìn)入胃后必定會(huì)與胃蛋白酶發(fā)生作用.然而目前對(duì)巴氯芬與胃蛋白酶相互作用后光譜性質(zhì)變化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.本文用光譜法研究了巴氯芬與胃蛋白酶相互作用,為探明巴氯芬對(duì)胃蛋白酶構(gòu)象的影響提供數(shù)據(jù).

1 儀器與試劑

UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津);L S-55型熒光/磷光發(fā)光分光光度計(jì) (美國(guó)PE公司);pHS-3C型精密酸度計(jì)(上海虹益儀表有限公司);SHZ-03恒溫水浴搖床(上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司);FTS 240型傅立葉變換紅外光譜(N icolet M agna-750Ⅱ).

巴氯芬(意大利M SDS公司);胃蛋白酶(1∶3000,蘇州吳縣生物化學(xué)廠).溶液用超純水配制.胃蛋白酶溶液用0.10 mol/L N aA c-HA c緩沖液(含0.10 mol/L N aCl以保持相同的離子強(qiáng)度)配制,以保持胃蛋白酶生理pH=2.00±0.02.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 巴氯芬對(duì)胃蛋白酶紫外光譜的影響

于2 mL 3.0×10-5mol/L胃蛋白酶液中加入不同體積的1.0×10-3mol/L巴氯芬溶液,定容至10.0 mL.靜置約0.5 h,以同濃度的巴氯芬作參比,記錄不同濃度的巴氯芬作用下胃蛋白酶的紫外吸收光譜.

2.2 巴氯芬對(duì)胃蛋白酶熒光光譜的影響

于5mL 1.0×10-5mol/L胃蛋白酶液中加入不同體積的1.0×10-3mol/L巴氯芬溶液,定容至10.0 mL.在一定溫度下靜置0.5 h,用恒溫循環(huán)水維持其溫度,分別在λex=278 nm 和λex=295 nm 處,于300～400 nm范圍掃描胃蛋白酶的熒光光譜及胃蛋白酶在巴氯芬作用下的熒光猝滅光譜.

2.3 巴氯芬對(duì)胃蛋白酶紅外光譜的影響

將少量巴氯芬與胃蛋白酶放入瑪瑙研缽中,加入少量水,充分研磨,直至水分烘干.以KBr為壓片,測(cè)定其紅外光譜,并扣除巴氯芬譜線,比較所得譜圖與胃蛋白酶譜圖.

3 結(jié)果與討論

3.1 巴氯芬對(duì)胃蛋白酶的紫外光譜

巴氯芬對(duì)胃蛋白酶紫外光譜的影響見(jiàn)表1.

由表1可見(jiàn),隨著巴氯芬濃度的升高,胃蛋白酶的吸光度變化不大,但最大吸收波長(zhǎng)隨巴氯芬濃度的升高而發(fā)生藍(lán)移.胃蛋白酶在266.5 nm處的吸收由多種因素所引起,如氨基酸殘基(T rp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Phe(苯丙氨酸))側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)光的吸收以及由于某些氫鍵的吸收、或與其構(gòu)象和螺旋有關(guān)的相互作用[4].隨著巴氯芬濃度的增加,胃蛋白酶體系發(fā)生藍(lán)移,說(shuō)明巴氯芬可能影響了胃蛋白酶T rp、Tyr及Phe殘基的微環(huán)境,并使其結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化,導(dǎo)致胃蛋白酶電子躍遷形式及能級(jí)差發(fā)生變化.

表1 巴氯芬-胃蛋白酶的紫外最大吸收光譜數(shù)據(jù)Tab.1 UV maximum absorption spectra data of baclofen-pepsin

3.2 巴氯芬對(duì)胃蛋白酶的熒光光譜

3.2.1 巴氯芬對(duì)胃蛋白酶的熒光猝滅作用

依照2.2的方法測(cè)定在不同濃度下巴氯芬對(duì)胃蛋白酶的熒光強(qiáng)度,結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 37℃下不同濃度巴氯芬對(duì)胃蛋白酶的熒光猝滅作用Fig.1 Quenching of fluorescence spectra of pepsin after treatment w ith different concentration of baclofen at 37℃

由于蛋白質(zhì)中T rp、Tyr、Phe的存在使其具有內(nèi)源熒光.此蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光可作為探針檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化[3].T rp、Tyr、Phe因?yàn)槠鋫?cè)鏈生色基團(tuán)的不同而有不同的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜.278 nm波長(zhǎng)激發(fā)時(shí),蛋白質(zhì)分子中的T rp和Tyr殘基受到激發(fā)(見(jiàn)圖1a),而295 nm波長(zhǎng)光僅激發(fā)蛋白質(zhì)分子中T rp殘基(見(jiàn)圖1b),所產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度和位置與這些殘基所處的微環(huán)境密切相關(guān)[5,6].

由圖1可見(jiàn),隨著巴氯芬濃度的升高,胃蛋白酶在278 nm和295 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下,其最大發(fā)射波長(zhǎng)均在347nm附近.而在278 nm激發(fā)波長(zhǎng)下,胃蛋白酶的熒光強(qiáng)度隨巴氯芬濃度的升高而降低,而在295 nm激發(fā)波長(zhǎng)下則變化不明顯.由此說(shuō)明,巴氯芬主要作用于胃蛋白酶中的Tyr殘基,并改變了Tyr所處的微環(huán)境,使其結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,導(dǎo)致胃蛋白酶的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅,而巴氯芬同T rp殘基的作用則較弱.

3.2.2 巴氯芬對(duì)胃蛋白酶內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)制

能使胃蛋白酶熒光發(fā)生猝滅的機(jī)制主要有2種,即動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅.動(dòng)態(tài)猝滅是由蛋白質(zhì)激發(fā)態(tài)分子和小分子物質(zhì)因熱運(yùn)動(dòng)發(fā)生碰撞而引起的,其作用過(guò)程符合Stern-Volmer方程[7]:

式(1)中Kq為Stern-Volmer猝滅常數(shù),ζ0為無(wú)猝滅劑時(shí)生物大分子的平均壽命,通常取值10-8s,Ksv為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù).依據(jù)Stern-Volmer方程,對(duì)F0/F和[Q]進(jìn)行線性回歸,所得37℃時(shí)Stern-Volmer方程及其相關(guān)系數(shù)如下:

由式(1)可得,巴氯芬對(duì)胃蛋白酶的熒光猝滅常數(shù)Kq=4.0×1010L/(mol·s),略大于猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)[9],說(shuō)明巴氯芬對(duì)胃蛋白酶的猝滅可能由動(dòng)態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅共同產(chǎn)生的.3.2.3 結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算

按文獻(xiàn)[9]公式(2),可算得巴氯芬在不同溫度下與胃蛋白酶的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù).

式(2)中,F0為空白胃蛋白酶的熒光強(qiáng)度;F為加入巴氯芬后的熒光強(qiáng)度;Kb為結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù);[Q]為巴氯芬濃度;通過(guò)公式(2)作圖lg[(F0-F)/F]～lg[Q],可得不同溫度下的線性方程,結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表2.

表2 不同溫度下巴氯芬與胃蛋白酶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Tab.2 Binding constants and binding sites between baclofen and pepsin at different temperatures

由表2可見(jiàn),巴氯芬與胃蛋白酶的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合數(shù)隨著溫度的升高而升高,這表明,升溫度有利于巴氯芬同胃蛋白酶的結(jié)合.

通過(guò)不同溫度下巴氯芬與胃蛋白酶的結(jié)合常數(shù),可根據(jù)熱力學(xué)公式(ΔG= ΔH-TΔS,且ΔG=-R T·lnK,得lnK=-ΔH/R T+ΔS/R),計(jì)算巴氯芬與胃蛋白酶結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù),所得結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 巴氯芬-胃蛋白酶體系的熱力學(xué)參數(shù)Tab.3 Thermodynam ic parameters of the baclofen-pepsin system

由表3可見(jiàn),巴氯芬與胃蛋白酶作用,均ΔG＜0,說(shuō)明反應(yīng)均為自發(fā)反應(yīng).依據(jù)熱力學(xué)常數(shù)及其大小確定作用力類(lèi)型[9]:當(dāng)ΔH＞0,ΔS＞0時(shí)為典型的疏水作用力;當(dāng)ΔH＜0,ΔS＞0時(shí)為氫鍵和范德華力;當(dāng)ΔH≈0或較小,ΔS＞0時(shí)為靜電作用力;當(dāng)ΔH＜0時(shí),靜電作用力為主要作用力.由此可見(jiàn),巴氯芬同胃蛋白酶的結(jié)合以疏水作用力為主.

3.2.4 巴氯芬與胃蛋白間的能量轉(zhuǎn)移

圖2為巴氯芬溶液的紫外吸收光譜(見(jiàn)圖2a)和胃蛋白酶溶液的熒光光譜(見(jiàn)圖2b).比較2圖譜,可見(jiàn)二者有重疊部分.根據(jù)F¨o rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[7],可認(rèn)為胃蛋白酶與巴氯芬之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移作用,從而使胃蛋白酶發(fā)生了熒光猝滅.

3.3 巴氯芬對(duì)胃蛋白酶紅外光譜的影響

Fig.2 Overlapping between the UV absorption spectra ofbaclofen(a)and em ission spectrum of pepsin(b)

依據(jù)2.3節(jié)方法,得胃蛋白酶及巴氯芬-胃蛋白酶的紅外圖譜,見(jiàn)圖3.

圖3 胃蛋白酶(a)與巴氯芬-胃蛋白酶混合物(b)的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectra of the pure pepsin(a)and the m ixture of baclofen and pepsin(b)

蛋白質(zhì)IR的酰胺I帶在1600～1700 cm-1(主要為C=O伸縮振動(dòng))有吸收;酰胺Ⅱ帶在l600～1500cm-1(主要為C—N伸縮振動(dòng)和N—H的彎曲振動(dòng))有吸收.酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的IR吸收峰的變化反映了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[10].由圖3可知,結(jié)合巴氯芬后,胃蛋白酶的酰胺I帶吸收峰的位置向低波數(shù)位移約5 cm-1,而酰胺Ⅱ帶(1533.8 cm-1)的吸收峰則變得非常微弱.此結(jié)果表明巴氯芬與胃蛋白酶發(fā)生作用后,使得胃蛋白酶多肽鏈的C—N或N—H發(fā)生了變化,并改變了胃蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu).

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Study of Interaction between Baclofen and Pepsin by SpectroscopyM ethods

L i B uhai,L iu Yuf ei,S un X iaom ei,W ang X ian
(Key L aboratory of A nalytical Chem istry of the State Ethnic A ffairs Comm ission,South-centralU niversity for N ationalitiesW uhan 430074,China)

The binding interaction between baclofen and pepsin was studied by ultraviolet absorption and fluorescence spectroscopies.Baclofen caused max imum of UV absorption peak of pepsin to undergo a blue shift.Stern-Volmer equation indicated that the fluorescence intensity of pepsin was quenched by baclofen via a static quenching mechanism,and the association constantswere calculated.The thermodynam ic parameters showed that the main binding force was hydrophobic inature.M eanwhile,according to the non-radiative energy transfer theory,there is a energy transfer between pepsin and baclofen,so that the fluorescence intensity of pepsin was quenched.FT-IR investigation showed that the secondary structure of pepsin has been changed by baclofen.

baclofen;pepsin;static quenching;spectroscopy

R971+.8;O657.3

A

1672-4321(2011)01-0021-04

2011-01-22

李步海(1946-),男,教授,研究方向:富集分離,E-mail:libh@scuec.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20705041)