李 勁,鄧志芳,高雯琪,胡文娟,劉 瑩,姚品芳,李廣燦,陳煥朝,梅之南

(1中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢430074;2中南民族大學(xué)藥學(xué)院,武漢430074;3湖北省腫瘤醫(yī)院,武漢430079)

中藥“龍泉復(fù)方”的不同配伍對(duì)腫瘤細(xì)胞系HepG-2和EC-1增殖的影響

李 勁1,鄧志芳1,高雯琪1,胡文娟1,劉 瑩1,姚品芳3,李廣燦3,陳煥朝3,梅之南2

(1中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢430074;2中南民族大學(xué)藥學(xué)院,武漢430074;3湖北省腫瘤醫(yī)院,武漢430079)

通過(guò)M TT(四甲基偶氮唑鹽)法繪制細(xì)胞增殖曲線觀察藥物對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG-2和食管鱗癌細(xì)胞系EC-1細(xì)胞增殖的影響,用熒光染色法進(jìn)一步確定”龍泉復(fù)方”有效成分誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的較佳配伍及其有效作用濃度范圍.結(jié)果表明:對(duì)抑制HepG-2細(xì)胞增殖有效作用的濃度:七味單方(馬錢(qián)子、山慈菇、喜樹(shù)果、龍葵、石上柏、青黛、紫菀)浸膏混合物和龍葵單方浸膏均＜125μg/mL,七味藥物復(fù)方總浸膏為250～1000μg/mL;對(duì)抑制EC-1細(xì)胞增殖有效作用的濃度:三味藥物混合浸膏(馬錢(qián)子,喜樹(shù)果、青黛提取的浸膏的混合物)＜50μg/mL和150～400μg/mL,七味單方混合浸膏＜25 μg/mL和50～400μg/mL,喜樹(shù)果單方浸膏為25μg/mL和50～200μg/mL;3種浸膏促進(jìn)EC-1細(xì)胞增殖的濃度依次為:50～100、25～50、25～50μg/mL.通過(guò)對(duì)EC-1熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的有效作用濃度:七位單方浸膏混合物為5～10μg/mL,三味藥復(fù)方混合浸膏為10～25μg/mL,喜樹(shù)果約為50μg/mL.研究結(jié)果提示,藥物濃度范圍和細(xì)胞系的不同導(dǎo)致其效果也不盡相同,臨床應(yīng)據(jù)具體情況調(diào)整,使之用藥少效果佳.

龍泉復(fù)方;配伍;藥物濃度;腫瘤細(xì)胞;M TT(四甲基偶氮唑鹽)法;AO/EB染色法

中藥“龍泉復(fù)方”為湖北省腫瘤醫(yī)院長(zhǎng)年用于治療肝癌、肺癌等多種腫瘤的一個(gè)中藥驗(yàn)方,該驗(yàn)方主要由九味中藥組成:馬錢(qián)子、山慈菇、喜樹(shù)果、龍葵、石上柏、青黛、紫菀、黃芪、靈芝.通過(guò)30多年的臨床應(yīng)用表明,該驗(yàn)方在一定程度上可改善患者生存質(zhì)量,減少?gòu)?fù)發(fā)和延長(zhǎng)生存期[1,2].由于在用藥過(guò)程中藥物配伍較多,幾味主藥如馬錢(qián)子的主要成分為生物堿,對(duì)人體有一定的毒性,對(duì)免疫功能可能存在一定影響[3].幾味主藥中,由喜樹(shù)果分離所得的喜樹(shù)果堿具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,已為主要抗癌藥物研究之一;山慈菇含秋水仙素,可抑制細(xì)胞的分裂[4];其另兩味多糖則可加強(qiáng)機(jī)體免疫功能,此外靈芝多糖和靈芝酸均被證實(shí)具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[5,6].

小鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)[3]說(shuō)明龍泉復(fù)方是治療腫瘤的很具前景的重要復(fù)方中藥.其作用機(jī)制可能是對(duì)腫瘤細(xì)胞直接的毒性作用和通過(guò)促進(jìn)免疫反應(yīng)的間接抑瘤作用[3].在整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)抑制作用的大小與所給藥量呈正比,復(fù)方制劑的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床效應(yīng)一致,且無(wú)明顯副作用,而且促進(jìn)了小鼠脾臟T細(xì)胞的特異性殺傷能力,增加了I型細(xì)胞因子I L-2和I N F-γ的表達(dá),從而促進(jìn)了細(xì)胞因子所介導(dǎo)的免疫反應(yīng),這可能與黃芪、靈芝和青黛促進(jìn)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促進(jìn)N K細(xì)胞殺傷功能和紅細(xì)胞免疫功能有關(guān)[7,8].在分子水平上,通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)到用藥后B7,H1的mRNA表達(dá)降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性[3].

本研究通過(guò)選取該藥方前七味單方進(jìn)行M TT法和細(xì)胞凋亡形態(tài)檢測(cè),對(duì)該藥方進(jìn)行初步篩選,通過(guò)藥物配伍間的對(duì)比和確認(rèn),盡可能找到比較合適的配伍,以便最大限度減少對(duì)人體毒性而達(dá)到最佳治療效果;盡可能地在細(xì)胞水平和分子水平上探索和發(fā)現(xiàn)可能機(jī)制,以促進(jìn)中藥在臨床應(yīng)用中形成穩(wěn)定的評(píng)價(jià)體系且取得穩(wěn)定療效,為科學(xué)的臨床用藥提供理論依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 藥材

青黛購(gòu)于福建省巨星青黛廠,其他所有藥材飲片均購(gòu)于湖北省天濟(jì)中藥飲片廠.

1.2 腫瘤細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG-2和食管癌細(xì)胞株EC-1均由武漢大學(xué)菌種保藏中心提供.

1.3 試劑

M TT(四甲基噻唑鹽),Ameresco分裝,批號(hào):0798;小牛血清,GI BCO 公司產(chǎn)品,批號(hào):30-2220F;DM EM 培養(yǎng)基,GB ICO公司產(chǎn)品,批號(hào):737181;T rypsin(胰蛋白酶),A eresco分裝,批號(hào):060530,吖啶橙(AO)、溴化乙啶(EB),Sigma公司產(chǎn)品;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱(日本三洋);熒光倒置顯微鏡(尼康);酶標(biāo)儀(thermo 354);96孔板和6孔板(日本產(chǎn)I

WA K I),培養(yǎng)瓶等耗材均為國(guó)產(chǎn).

2 方法

2.1 提取物的制備

2.1.1 生物總堿的提取

將中藥飲片用機(jī)械粉碎,或全驗(yàn)方混合,或除青黛、黃芪、靈芝以外6種飲片分別以95% 乙醇浸泡過(guò)夜(反復(fù)3次以上),減壓蒸餾后離心分離,取沉淀加1%HA c溶解,調(diào)pH至3,乙酸乙酯萃取取下相,再加10%氨水調(diào)pH至10,并用乙酸乙酯萃取取上相得萃取液,減壓蒸餾后回收乙酸乙酯用1～2 mL 95% 乙醇溶解后冷凍干燥得浸膏或粉末[9].全過(guò)程于避光下進(jìn)行.

2.1.2 青黛有效部位的提取

稱取一定量青黛粉經(jīng)鹽酸處理后用乙酸乙酯提取2次,回收乙酸乙酯,得濃縮液,再加95%乙醇轉(zhuǎn)溶,加1%N aOH放置1 d,80℃干燥得提取物粗品[10].

2.2 M TT法測(cè)定

稱取一定重量藥物提取浸膏,用有機(jī)溶劑(VDMSO＜0.1%V總體積)溶解后配制成不同濃度的藥物培養(yǎng)基.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2和EC-1細(xì)胞,用含10%小牛血清的低糖DM EM 培養(yǎng)液接種于96孔板中(細(xì)胞數(shù)為每孔1×104個(gè)),每孔100μL/mL培養(yǎng)72 h后,加入不同濃度的藥物及配伍(分全驗(yàn)方混合提取物,七味單方提取物混合,三味單方提取物混合和各單方提取物設(shè)組),每個(gè)濃度設(shè)平行孔3個(gè),于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h.每孔加入100μL DM SO溶解,于酶標(biāo)儀492 nm處檢測(cè)OD值,計(jì)算藥物的體外生長(zhǎng)細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%.

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC-1細(xì)胞接種于已放置好蓋玻片的6孔板培養(yǎng)板中(細(xì)胞數(shù)為每孔1×104個(gè)),每孔1mL培養(yǎng)12 h后,加入不同濃度的藥物及配伍于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h.取出蓋玻片倒置于點(diǎn)有10μL混合熒光染色液的100μg/mL AO和100μg/mL EB的載玻片上,于熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài).

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 M TT法

通過(guò)初步篩選各藥物有效部位群及其各個(gè)組合對(duì)HepG-2和EC-1細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2.

圖1 各類型藥物對(duì)HepG-2細(xì)胞的抑制作用Fig.1 Inhibition curve of various drugs on HepG-2 cell

由圖1可知,對(duì)于HepG-2細(xì)胞,一般藥物隨著藥物濃度的增加抑制率升高,而低濃度時(shí)更為顯現(xiàn),但七味藥物總浸膏濃度＜500μg/mL時(shí)有促進(jìn)細(xì)胞增殖的傾向,500～1000μg/mL范圍作用較明顯,七味單方混合浸膏和龍葵浸膏濃度＜125μg/mL均有明顯抑制作用.因此,七味單方混合浸膏和龍葵為濃度＜125μg/mL用藥的候選藥方配伍.

由圖2可知,對(duì)于EC-1細(xì)胞,當(dāng)用藥濃度＜25 μg/mL均有明顯的抑制作用,當(dāng)濃度為25～50μg/mL,喜樹(shù)果浸膏對(duì)細(xì)胞有促進(jìn)增長(zhǎng)作用,當(dāng)濃度為50～200μg/mL則達(dá)到最高抑制率;三味藥混合浸膏濃度在50～100μg/mL可刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),由150 μg/mL始逐步對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用.

圖2 各類型藥物對(duì)EC-1細(xì)胞的抑制作用Fig.2 Inhibition curve of various drugs on EC-1 cell

3.2 “龍泉復(fù)方”對(duì)EC-1細(xì)胞作用的形態(tài)學(xué)觀察

以三味混合浸膏為代表,通過(guò)不同濃度的藥物處理經(jīng)AO/EB染料染色后,選取了以上2種濃度對(duì)應(yīng)的形態(tài)圖(見(jiàn)圖3).圖3-1為對(duì)照組,明顯無(wú)凋亡細(xì)胞出現(xiàn);當(dāng)1μg/mL浸膏作用細(xì)胞72 h后,細(xì)胞出現(xiàn)了早期凋亡特征:細(xì)胞呈現(xiàn)綠色,細(xì)胞核固縮成新月形或顆粒狀,并位于細(xì)胞一側(cè),而紅色為少量壞死細(xì)胞(見(jiàn)圖3-2);當(dāng)加大藥物濃度時(shí),細(xì)胞呈現(xiàn)早期凋亡形態(tài),周圍出現(xiàn)了泡狀的凋亡小體,同時(shí)伴隨有少量壞死細(xì)胞(見(jiàn)圖3-3).

圖3 不同濃度下的細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Cellmorphology in different concentration

通過(guò)形態(tài)學(xué)初步觀察,七位單方混合浸膏的較佳促使細(xì)胞凋亡的用藥濃度為5～10μg/mL,三味藥混合浸膏為10～25μg/mL,喜樹(shù)果約50μg/mL.

4 討論

本研究首先采用M TT法進(jìn)行初步的篩選,以大致判斷藥物及藥物配伍作用的有效范圍,從而為準(zhǔn)備尋找合適的濃度提供基礎(chǔ);然后通過(guò)形態(tài)學(xué)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)作出具體判斷,進(jìn)而確定藥物對(duì)細(xì)胞的作用程度:AO/EB雙重染色后熒光顯微鏡下檢測(cè),對(duì)正常細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞作出明確判斷,被認(rèn)為是反映細(xì)胞凋亡的一個(gè)定性定量指標(biāo)[11].因此,在M TT法的基礎(chǔ)上,通過(guò)熒光雙重染色后的細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察,可用作檢測(cè)和初步判斷藥物有效成分作用的一個(gè)簡(jiǎn)便方法.通過(guò)對(duì)中藥“龍泉復(fù)方”成分的分析,發(fā)現(xiàn)可減少配伍而達(dá)到在細(xì)胞水平上表現(xiàn)出相同或相似療效的配伍和濃度范圍.不同種類的細(xì)胞系,其有效配伍不同,在所篩選的藥物中不同藥物濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響不同,在保證有效的前提下應(yīng)調(diào)整藥物濃度而取得最好的治療效果.通過(guò)初步篩選得到3種較佳藥方配伍,但在人體整體水平上是否均可達(dá)到相同的效果,則待用其他方法進(jìn)一步研究以確定最終理想的配伍和濃度范圍.

中藥復(fù)方并非簡(jiǎn)單相加,其療效也因提取方法的不同而產(chǎn)生很大差異,本研究運(yùn)用化學(xué)方法提取有效部位群,在分子和細(xì)胞水平上分析對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)作用,以優(yōu)化配伍.通過(guò)M TT抑制率曲線發(fā)現(xiàn),抑制率并非隨濃度增大而加大,而是在不同藥物濃度范圍其抑制率會(huì)發(fā)生波動(dòng).不同細(xì)胞對(duì)于同一種藥物的敏感性也不盡相同,在部分濃度區(qū)間,出現(xiàn)刺激細(xì)胞加速生長(zhǎng)的現(xiàn)象.這可能因藥物對(duì)細(xì)胞作用過(guò)程中由于中藥的多靶點(diǎn)作用而誘導(dǎo)多個(gè)耐藥相關(guān)蛋白達(dá)到多藥耐藥的作用所致,而不同藥物濃度可能觸發(fā)不同藥物作用和代謝調(diào)控過(guò)程,導(dǎo)致藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞毒殺或誘導(dǎo)的有效和無(wú)效,甚至于刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),但即使是藥物作用后引起加速生長(zhǎng)的細(xì)胞,其形態(tài)已經(jīng)出現(xiàn)了非正常變化.通過(guò)對(duì)多藥耐藥的長(zhǎng)期研究,已有研究發(fā)現(xiàn)了相關(guān)蛋白,其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被發(fā)現(xiàn)與CSCs(腫瘤干細(xì)胞)密切相關(guān)[12].不同的細(xì)胞對(duì)于不同的藥物配伍,其耐藥區(qū)間也有差別的,如EC-1和HepG-2細(xì)胞在有效藥物濃度和耐藥性出現(xiàn)濃度即有明顯差異.

中、西醫(yī)是兩種獨(dú)立的醫(yī)療體系,雖然對(duì)疾病的病因等有不同的認(rèn)識(shí),但就分子水平而言,二者有融會(huì)貫通之處.如不同中藥在全方中的“君臣佐使”作用和“扶正驅(qū)邪”等.中醫(yī)和西醫(yī)完美結(jié)合體現(xiàn)“君臣佐使”作用的一個(gè)經(jīng)典例子即為復(fù)方雄黃-青黛-丹參治療急性早幼粒性白血病,非常經(jīng)典地解析和闡明了一個(gè)完全依據(jù)中醫(yī)理論研發(fā)出來(lái)的中藥復(fù)方,在細(xì)胞和分子水平的明確的作用靶點(diǎn)和機(jī)制.對(duì)于本復(fù)方而言,兩味多糖從免疫方面“扶正固本”,七味其他中藥從毒殺腫瘤細(xì)胞方向在機(jī)體內(nèi)“破血驅(qū)邪”.但由于中藥使用過(guò)程中的穩(wěn)定性和質(zhì)量的可控性不如西藥,且作用機(jī)制復(fù)雜,對(duì)于療效的評(píng)價(jià)沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),因此通過(guò)本研究探尋用西醫(yī)的方法以盡可能地增加中藥臨床用藥的穩(wěn)定性和療效性.在細(xì)胞和分子水平上,本研究并未探尋通常認(rèn)為黃芪和靈芝類提高和刺激機(jī)體免疫力藥物的作用,該兩味藥與其它七味以生物堿為主毒殺腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的作用方式不同,需從細(xì)胞免疫和分子免疫角度進(jìn)行研究.它們作為該驗(yàn)方的組成部分,在整體動(dòng)物模型中對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用和分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

本研究表明該驗(yàn)方對(duì)不同的癌癥的用藥濃度不盡相同,甚至配伍也可適當(dāng)改變以適應(yīng)不同的患者.

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D ifferent Compatibility of ChineseM edicine"Longquan Compound"Effect on HepG-2 and EC-1 Cell L ine Proliferation

L i J in1,D eng Zhif ang1,GaoW enqi1,H u W enjuan1,L iu Y ing1,Yao P inf ang3,L i Guangcan3,Chen H uanchao3,M ei Zhinan2
(1 College of L ife Science,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China;2 College of Pharmacy,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China;3 HubeiCancer Hospital,W uhan 4300749,China)

The cell proliferation curve and observation on the effect of the cells of HepG-2 and EC-1 caused by the drugswere obtained through themethod ofM TT(methyl thiazolyl tetrazolium),and the opt imal compatibility and concentration of the drugs were determ ined by fluorescence staining.It is shown that the seven-m ixed drug(the major effective components extracted from strychnine,mountain keats mushroom,common camptotheca fruit,solanum nigrum,stone cypress,natural indigo and tatarian aster root)and solanum nigrum are both effective below 125 μg/mL,and the range for the seven-drug m ixture(m ixed before extraction)is between 250-1000 μg/mL for HepG-2 cell.W hile for EC-1,the effective ranges of the three-m ixed drugn (the major effective components extracted from strychnine,common camptotheca fruit and natural indigo)are below 50?g/mL and between 150-400 μg/mL;the seven-m ixed drug's ranges are below 25 μg/mL and between 50-400 μg/mL;for common camptotheca fruit,the effective ranges are below 25 μg/mL and between 50-200 μg/mL.However,the concentrations of those three different drugs which caused prolification of EC-1 are between 50-100μg/mL,25-50 μg/mL and 25-50 μg/mL,respectively.From the results of the more accurate method of fluorescence staining,it is found that the ranges for the seven-m ixed drug;the three-m ixed drug;and the common camptotheca fruit are 5-10 μg/mL,10-25μg/m and about 50μg/mL respectively.The selected compatibility showed obvious inhibition on cancer cells.The results indicate that different concentrations and cancer cells lead to different effect,the drugs and concentrations should be chosen and adjusted in different condition in order to obtain good effect w ith less amounts.

Longquan compound;compatibilities;concentration;M TT;HepG-2 and EC-1 cell;AO/EB staining

R944.6+5;Q 279

A

1672-4321(2011)01-0046-04

2010-11-23

李 勁(1962-),男,博士,副教授,研究方向:分子腫瘤學(xué),E-mail:lijin@mail.scuec.edu.cn

國(guó)家民委自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(07ZN 09);湖北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(JX4B36)