王朝元,徐 宗

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢430074)

石見(jiàn)穿萃取物對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞活性的影響

王朝元,徐 宗

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢430074)

石見(jiàn)穿以95%乙醇抽提得總提物.分別用不同試劑萃取總提物,獲得其石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及其水溶性成分.以體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞M C3T3-E1為模型,用cck-8法測(cè)定細(xì)胞增殖,堿性磷酸酶(AL P)試劑盒法測(cè)定了上述不同萃取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的影響.結(jié)果表明:總提物在濃度10-3、10-4、10-5mg/mL時(shí)和10-3mg/mL乙酸乙酯萃取物具有極顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖 (P＜0.01)作用.10-4mg/mL總提物和10-3mg/mL乙酸乙酯萃取物顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞AL P活性(P＜0.05).研究表明石見(jiàn)穿乙酸乙酯萃取物含有能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和成骨活性的有效成分.

石見(jiàn)穿;萃取物;成骨細(xì)胞;細(xì)胞增殖;成骨活性.

石見(jiàn)穿(S alvia chinensisBenth)為唇形科植物華鼠尾草的地上部分[1,2],作為常用草藥,其名見(jiàn)于《本草綱目》僅有療效記載,本品曾收載于《中國(guó)藥典》(1997年版)一部,為中草藥的一種.其療效包括清熱解毒,活血止痛等.在中醫(yī)中可用于治療急慢性肝炎[3]、腎炎、風(fēng)濕骨痛、癌癥[4]、面神經(jīng)麻痹、白帶、痛經(jīng)[5]、淋巴結(jié)結(jié)核、乳腺炎、跌打損傷、蛇咬傷、癰腫熱痛等癥,尤其具有治療骨病的療效.李時(shí)珍在《本草綱目》卷二十一草部記載有石見(jiàn)穿用于治療骨痛.中醫(yī)臨床研究證實(shí)其具有一定的治療骨相關(guān)疾病的療效,包括:治療風(fēng)濕骨痛,跌打損傷的療效[2].但是,其何種成分對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和成骨活性有促進(jìn)作用還不明確.石見(jiàn)穿對(duì)成骨細(xì)胞的代謝的影響尚未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道.因此,本研究旨在通過(guò)分離石見(jiàn)穿的不同組分,研究其具有治療骨病療效的有效成分,以期進(jìn)一步研究其作用機(jī)理[6-10].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

石見(jiàn)穿藥材采自湖北省利川縣并保存于中南民族大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本館,經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬(wàn)定榮教授鑒定確認(rèn)后用于本實(shí)驗(yàn).其它主要試劑:己烯雌酚(DES)(購(gòu)自武漢銀信);新生小牛血清(美國(guó)Gibco Corporation);DEM E培養(yǎng)基(新西蘭HyClone Corporation)、胰蛋白酶(杭州吉諾公司);CCK-8(日本同仁化學(xué)公司);堿性磷酸酶(AL P)試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)、考馬斯亮蘭試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司).小鼠成骨樣細(xì)胞系M C3T3-E1(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所).

1.1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(HF151UV CO2培養(yǎng)箱,上海力申科學(xué)儀器有限公司);XDS-1B型倒置生物顯微鏡(重慶光電儀器總公司);ELX808型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng)).

1.2 方法

1.2.1 藥物的制備

稱(chēng)取石見(jiàn)穿5 kg,經(jīng)95%的乙醇浸泡24 h后過(guò)濾,殘?jiān)^續(xù)經(jīng)95%的乙醇浸泡24 h,過(guò)濾,如此反復(fù)3次,合并濾液,減壓回收溶劑獲得浸膏189 g.浸膏用90%的甲醇溶液溶解,為總提物.部分總提物用石油醚萃取.溶液分為2層,上層為石油醚部位,減壓回收得石油醚萃取物;下層部分用乙酸乙酯萃取.溶液分為2層,上層為乙酸乙酯部位,減壓回收得乙酸乙酯萃取物;下層為水層加入等量正丁醇萃取,回收上層得正丁醇萃取物;下層為水部位,減壓回收得水萃取物.

稱(chēng)取已經(jīng)真空干燥后所得恒重的總提物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水萃取物浸膏各0.01 g,加200μL DM SO 溶解,取其中100μL加入50mL培養(yǎng)基,用微孔濾膜過(guò)濾除菌,制成濃度10-1mg/mL藥液.取此藥液用培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5mg/mL不同濃度梯度備用.陽(yáng)性對(duì)照:稱(chēng)取0.01 g己烯雌酚,用200μL DM SO 溶解,再以含10%小牛血清M EM 培養(yǎng)基稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mg/mL 過(guò)濾除菌備用. 陰性對(duì)照液:不加藥的10% 小牛血清培養(yǎng)基.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用10%小牛血清的DM EM培養(yǎng)基培養(yǎng)M C3T3-E1細(xì)胞.細(xì)胞傳代時(shí),將長(zhǎng)滿(mǎn)M C3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液傾倒,用PBS清洗2次,在培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL,消化2～3 m in,待大多數(shù)細(xì)胞變圓脫落,加入4 mL滅菌的10%的小牛血清和雙抗的培養(yǎng)液終止消化.1500 r/m in離心沉淀細(xì)胞.

1.2.3 成骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1)CCK-8法吸光度與細(xì)胞數(shù)目曲線(xiàn)測(cè)定.將收獲的成骨細(xì)胞分別以密度0、0.2×104、0.4×104、0.8×104、1.6×104細(xì)胞/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h,每種處理設(shè)5個(gè)復(fù)孔.采用cck-8法[11],用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定各孔的吸光度.

2)不同萃取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響.按密度0.4×104細(xì)胞/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h,換液,加入含相應(yīng)萃取物的培養(yǎng)基100μL,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔.同時(shí)以不加藥培養(yǎng)基為空白對(duì)照,以己烯雌酚為陽(yáng)性對(duì)照.培養(yǎng)72 h后,向每孔加入10 μL cck-8,3 h時(shí)后測(cè)定OD值[11].

1.2.4 成骨細(xì)胞分化功能測(cè)定

1)AL P試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定.細(xì)胞懸液分別以密度 0、0.2×104、0.4×104、0.8×104、1.6×104、3.2×104細(xì)胞/孔接種于96孔板,每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h,加0.1%T riton X-100/PBS液裂解細(xì)胞12 h,按AL P試劑盒介紹的方法測(cè)定成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性.

2)不同萃取物對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響.細(xì)胞懸液按1×105細(xì)胞/孔密度接種于96孔板,培養(yǎng)24 h,更換含藥培養(yǎng)基,每孔100μL,繼續(xù)培養(yǎng)7 d后裂解細(xì)胞,按AL P試劑盒法于520 nm處測(cè)定吸光度,按考馬斯亮蘭法于595 nm處測(cè)定蛋白質(zhì)含量(g/L).AL P活性以U/gprot表示.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行顯著性差異分析處理,當(dāng)P≤0.05,表示兩者有顯著差異;當(dāng)P≤0.01,表示兩者有極顯著差異.

2 結(jié)果

2.1 石見(jiàn)穿萃取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 CCK-8法線(xiàn)性關(guān)系考察

以5孔吸光度的平均值(y)與細(xì)胞數(shù)(x)作線(xiàn)性回歸,得回歸方程:y=0.2396x+2.5503(R2=

0.9981,n=5).由圖1可見(jiàn),在(0～1.6×104)細(xì)胞/孔范圍內(nèi),細(xì)胞數(shù)與吸光度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系.

y=0.2396x+2.5503;R2=0.9981圖1 CCK-8線(xiàn)性關(guān)系Fig.1 L inear relationship between cell number and absorbance at 450nm in CCK-8 assay

2.1.2 不同萃取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

以圖1結(jié)果為基礎(chǔ),按0.4×104細(xì)胞/孔接種96孔板,并用萃取物處理細(xì)胞,結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可知,10-3～10-5mg/mL總提物明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖(P＜0.05);10-3～10-5mg/mL乙酸乙酯萃取物能極明顯地促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖(P＜0.01),增值率達(dá)到39%,正丁醇部位10-1、10-2、10-5能明顯地促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖(P＜0.05).且所有藥物處理組的細(xì)胞增殖率均高于陽(yáng)性對(duì)照組.

2.2 石見(jiàn)穿萃取物對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響

2.2.1 AL P試劑盒法線(xiàn)性關(guān)系的考察

以5孔吸光度的平均值(y)與細(xì)胞數(shù)目(x)作線(xiàn)性回歸,得回歸方程:y=0.03955x+1.1067(R2=0.9741,n=5).由圖2可見(jiàn),在(0～ 3.2×104)細(xì)胞/孔范圍內(nèi),細(xì)胞數(shù)與吸光度(AL P活性)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系.

表1 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effect of extracts on proliferation ofMC3T3-E1

圖2 堿性磷酸酶試劑盒線(xiàn)性關(guān)系Fig.2 L inear relationship between ALP and cell numbers

2.2.2 石見(jiàn)穿萃取物對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響

成骨細(xì)胞總蛋白測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2.以圖2結(jié)果為基礎(chǔ),細(xì)胞懸液按1×105細(xì)胞/孔接種于96孔板,并用萃取物處理成骨細(xì)胞,結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可知,10-3～10-5mg/mL 總萃取物,10-4～10-5mg/mL乙酸乙酯萃取物,10-3mg/mL正丁醇萃取物能明顯提高成骨細(xì)胞AL P活性水平(P＜0.05),尤其10-3mg/mL乙酸乙酯萃取物能極顯著提高成骨細(xì)胞AL P活性水平(P＜0.01).其它萃取物對(duì)成骨細(xì)胞 的分化均無(wú)明顯影響.

表2 細(xì)胞的蛋白質(zhì)總量Tab.2 Total protein mass of cell

表3 石見(jiàn)穿對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響Tab.3 Effect of extract on osteoblast activity

3 討論

本研究首次以體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞M C3T3-E1為模型,研究了石見(jiàn)穿萃取物對(duì)骨細(xì)胞增殖和成骨活性的影響.結(jié)果表明石見(jiàn)穿的部分萃取物對(duì)成骨細(xì)胞均具有一定的促進(jìn)增殖和成骨活性的影響.由此對(duì)于進(jìn)一步研究石見(jiàn)穿治療骨折藥效的機(jī)理提供了基礎(chǔ).

研究結(jié)果表明,石見(jiàn)穿的多種萃取物對(duì)成骨細(xì)胞均具有一定的促進(jìn)增殖的作用.其中,以乙酸乙酯萃取物的效果最好.一般乙酸乙酯萃取物的成分主要為黃酮類(lèi)化合物,該類(lèi)化合物已證實(shí)對(duì)骨折的愈合具有較好的促進(jìn)作用.而骨折的愈合與成骨細(xì)胞的增殖和分化有密切關(guān)系.因此,筆者初步判斷,石見(jiàn)穿的乙酸乙酯萃取物可能含有促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨活性的該類(lèi)化合物.

堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞活性的主要標(biāo)志.在骨骼發(fā)育及骨折愈合等情況下,旺盛生長(zhǎng)和分化的成骨細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的堿性磷酸酶活性.與上述細(xì)胞增殖結(jié)果一致,石見(jiàn)穿的乙酸乙酯萃取物對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用.

此研究初步證實(shí)了石見(jiàn)穿治療骨折的藥效,筆者下一步將進(jìn)一步分離純化石見(jiàn)穿的化學(xué)組分,分析各組分對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化的影響,以期查明其治療骨病的有效成分,為未來(lái)開(kāi)發(fā)該藥提供依據(jù).

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Effects of Extract fromSalivia chinensisBenth on Proliferation and Activity of OsteoblasticMC3T3-E1 Cell in Vitro

W ang Chaoyuan,X u Zong
(College of L ife Science,South-centralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

S alivia chinensisBenth were extracted w ith different solvents and the effects of the extracts on the proliferation and differentiation of osteoblast were investigated.S alivia chinensisBenth was first extracted w ith 95% ethanol followed seperately by extracted w ith petroleum ether,ethylacetete or butyl alcohol.M C3T3-E1 osteoblast-like cellswere used as in vitro model to test the effects of different fractions on osteoblast proliferation and differentiation.It was found that the general extract of 10-3,10-4,10-5mg/mL and the ethylacetete fraction of 10-3mg/mL could st imulate cell proliferation(P＜0.01).M oreover,the general fraction of 10-4mg/mL and ethylacetete fraction 10-3mg/mL enhance alkaline phosphatase(AL P)activity of M C3T3-E1(P＜0.05). It is conclusion that the components in the ethylacetate fraction fromS alivia chinensisBenth can st imulate osteoblast proliferation and differentiation.

S alivia chinensisBenth;extract;osteoblast;proliferation;osteogenic activity

Q 949.777.6;Q 253

A

1672-4321(2011)01-0033-04

2010-10-10

王朝元(1964-),男,副教授,研究方向:生物醫(yī)學(xué)工程,E-mail:wangcyscu2001@yahoo.com

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2009CDZ033)