沈靜茹,林 敏,余學(xué)紅,何本榮

(1中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430074;2中南民族大學(xué)校醫(yī)院,武漢430074)

簡(jiǎn)易HPCE法分離檢測(cè)撲爾敏對(duì)映異構(gòu)體

沈靜茹1,林 敏1,余學(xué)紅2,何本榮1

(1中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430074;2中南民族大學(xué)校醫(yī)院,武漢430074)

采用高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法分離撲爾敏手性異構(gòu)體,建立了簡(jiǎn)易HPCE法分離檢測(cè)撲爾敏對(duì)映體含量的方法.在國(guó)產(chǎn)儀器上,以未涂層石英毛細(xì)管柱(75μm)、pH2.5、T ris-磷酸緩沖液(40mmol/L)、分離電壓25 kV、進(jìn)樣時(shí)間1m in、檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm、溫度20℃條件下?lián)錉柮魞蓪?duì)映體實(shí)現(xiàn)了基線分離,分離度可達(dá)10.64.撲爾敏消旋體濃度在0.001～0.10 mg/mL范圍內(nèi),峰高、峰面積與濃度呈線性關(guān)系,峰面積線性關(guān)系好于峰高,兩峰峰面積線性相關(guān)系數(shù)r可達(dá)0.99883和0.99128,前峰的峰高及峰面積精密度實(shí)驗(yàn)表明,RSD(5次)分別為7.97%和8.29%.在未構(gòu)建其他手性環(huán)境的條件下,該方法使撲爾敏兩對(duì)映異構(gòu)體達(dá)到快速分離,據(jù)此建立的測(cè)定方法可用于實(shí)際樣品的含量測(cè)定.

高效毛細(xì)管電泳法;分離;測(cè)定;撲爾敏手性異構(gòu)體

目前,撲爾敏(又名馬來酸氯苯那敏,或氯屈末通,或馬來酸氯苯吡啶)作為一種優(yōu)良的抗組胺藥物,已被廣泛應(yīng)用于日常抗過敏、抗感冒治療中.撲爾敏是手性藥物,其中右旋撲爾敏的藥理活性較外消旋體強(qiáng),約為后者的2倍,副作用更輕微少見[1],進(jìn)行撲爾敏手性異構(gòu)體分離分析研究,對(duì)于控制撲爾敏藥品質(zhì)量,降低其潛在的毒副作用,具有重要意義.近年來?yè)錉柮魧?duì)映體分離的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中于構(gòu)建手性環(huán)境的方法,如構(gòu)建HPCE流動(dòng)相手性環(huán)境的添加β-環(huán)糊精的毛細(xì)管電泳-方波安培分離檢測(cè)法[2]、環(huán)糊精衍生物做手性添加劑的毛細(xì)管電泳法[3-5]以及采用含有手性固定相或手性添加劑的高效液相色譜法分離撲爾敏對(duì)映體的工作[6].

本研究以國(guó)產(chǎn)HPCE儀、國(guó)產(chǎn)普通75μm未涂層石英毛細(xì)管柱、單一緩沖體系,不添加任何手性添加劑分離撲爾敏對(duì)映異構(gòu)體.建立了無需營(yíng)造額外手性環(huán)境,即不使用有填充物的手性電泳柱或在流動(dòng)相中加添加劑的方式,僅憑借單一緩沖體系直接分離撲爾敏對(duì)映體,以達(dá)到理想的分離效果(未見文獻(xiàn)報(bào)道),同時(shí)藉此可建立靈敏的、簡(jiǎn)易快速的兩對(duì)映異構(gòu)體含量測(cè)定的新方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

1.1.1 儀器

CL 1020型高效毛細(xì)管電泳儀(北京彩陸科學(xué)儀器有限公司、中國(guó)科學(xué)院研究生院應(yīng)用化學(xué)所)、pHS-3C型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器儀表廠)、融硅石英毛細(xì)管(75μm,I D,有效長(zhǎng)度40 cm,永年光纖廠,河北省永年縣)、0.22μm 微孔濾膜(上海市新亞凈化儀器廠).

1.1.2 試劑

三羥甲基氨基甲烷(T ris)(上海山浦化工有限公司)、磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、鹽酸(信陽(yáng)市化學(xué)試劑廠)、馬來酸氯苯那敏片(上?；氏箬F力藍(lán)天制藥有限公司,湖北華中藥業(yè)有限公司,)、馬來酸氯苯那敏對(duì)照品(含量99.7%、中國(guó)藥品生物制品檢定所)、超純水,其他試劑均為分析純.

1.2 前處理

1.2.1 藥品處理

馬來酸氯苯那敏片(4 mg/片)于少量無水乙醇中搗碎溶解,用超純水稀釋至不同濃度后過濾,馬來酸氯苯那敏對(duì)照品(含量99.7%)用超純水配置成0.016mg/mL過濾,配置不同濃度的T ris-磷酸緩沖液,按分離所需調(diào)pH值,所用溶液均用0.22μm 微孔濾膜過濾,作為電泳的運(yùn)行介質(zhì).

1.2.2 高效毛細(xì)管電泳分析預(yù)處理

HPCE柱每次運(yùn)行之前依次用0.1mol/L HCl、超純水、背景電解質(zhì)各沖洗6 m in.采取注射器壓力進(jìn)樣1m in,分離電壓為25 kV,檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm,溫度20℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 分離電壓的變化對(duì)分離情況的影響

分離電壓是影響分離的一個(gè)重要因素.在pH 2.5,濃度40 mmol/L T ris-磷酸緩沖液中,撲爾敏樣品濃度0.016mg/mL、進(jìn)樣1m in、檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm、20℃的電泳條件下,分別考察了20,23,24,25,26,27,30 kV時(shí)撲爾敏對(duì)映體的分離情況.

在國(guó)產(chǎn)儀器上,分離電壓小于24 kV時(shí),撲爾敏對(duì)映體得不到分離,顯然此電壓不能使兩對(duì)映體產(chǎn)生分離;當(dāng)分離電壓大于27 kV時(shí),撲爾敏對(duì)映體亦得不到分離或響應(yīng)值很小(見表1).在分離電壓為24,25,26 kV時(shí)撲爾敏兩對(duì)映體洗脫強(qiáng)度大,基線平穩(wěn),且能達(dá)到基線分離,分離度也較大,故選擇25 kV作為撲爾敏對(duì)映體分離的最佳電壓條件.

表1 不同分離電壓對(duì)撲爾敏對(duì)映體分離的影響Tab.1 Separation of chlorpheniram ine w ith different voltage

2.2 緩沖液pH值的變化對(duì)分離情況的影響

緩沖液的pH對(duì)分離有較大影響.當(dāng)40 mmol/L T ris-磷酸為緩沖溶液、分離電壓25 kV、檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm、進(jìn)樣1 m in、20℃的電泳條件下,撲爾敏樣品濃度為0.016 mg/mL.改變緩沖液的pH值(1.0～4.5范圍),以考察對(duì)分離情況的影響.當(dāng)緩沖液的pH＜2.4時(shí),撲爾敏對(duì)映體得到部分分離;當(dāng)緩沖液pH＞3.5時(shí),撲爾敏對(duì)映體基本不分離,隨著緩沖液pH的增大,出峰時(shí)間也呈逐漸拖后的現(xiàn)象;當(dāng)緩沖液pH為2.5時(shí),撲爾敏兩對(duì)映體達(dá)到基線分離,說明緩沖液酸度對(duì)分離選擇性起著決定性的作用,唯有此酸度條件下兩對(duì)映體的表觀淌度方有很大差異,達(dá)到了基線分離的分離效果.故選擇緩沖液pH為2.5(見圖1).

(A)pH 2.4;(B)pH 2.5;(C)pH 3.5圖1 不同緩沖液pH下?lián)錉柮魧?duì)映體分離圖Fig.1 Separation of chlorpheniram ine w ith pH different buffer

2.3 緩沖液濃度的變化對(duì)分離情況的影響

在pH 2.5的T ris-磷酸緩沖液、分離電壓25 kV、波長(zhǎng)214 nm、進(jìn)樣1 m in、溫度20℃的電泳條件下,撲爾敏樣品濃度為0.016 mg/mL,改變緩沖液T ris-磷酸的濃度(分別為20,30,40,50,60 mmol/L),以其考察對(duì)分離情況的影響.在所有T ris-磷酸濃度條件下,撲爾敏兩對(duì)映體其分離度均可＞10;當(dāng)T ris-磷酸濃度＜40mmol/L,隨著T ris-磷酸緩沖液濃度的增加,峰高、峰面積的響應(yīng)值逐漸增大,兩峰在40 mmol/L時(shí)的出峰時(shí)間最短,響應(yīng)值最大(見圖2);當(dāng)T ris-磷酸濃度＞40mmol/L,其響應(yīng)值反而逐漸減小,說明T ris-磷酸濃度為40mmol/L時(shí)該緩沖液對(duì)撲爾敏對(duì)映體的洗脫強(qiáng)度最佳,故選定40 mmol/L T ris-磷酸為撲爾敏對(duì)映體分離的最佳緩沖液濃度.

圖2 不同濃度緩沖液對(duì)撲爾敏對(duì)映體分離度的影響Fig.2 Separation of chlorpheniram ine w ith different buffer concentration

2.4 方法評(píng)價(jià)與應(yīng)用

2.4.1 撲爾敏對(duì)映體分離的線性范圍

在最佳HPCE分離條件(pH 2.5、40 mmol/L tris-磷酸緩沖液、分離電壓25 kV、檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm、進(jìn)樣時(shí)間1 m in)下,配制不同濃度撲爾敏對(duì)照品溶液,得到撲爾敏對(duì)映體的電泳峰峰高、峰面積與濃度呈線性關(guān)系.其中,前峰在撲爾敏濃度0.001～0.10 mg/mL范圍有線性相關(guān)性:峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 2.71×104+6.97×106x,線性相關(guān)系數(shù)r=0.986 75;峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.08×105+4.35×107x,相關(guān)系數(shù)r=0.99883;后峰在撲爾敏濃度0.001～0.10 mg/mL范圍有線性關(guān)系:峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6.82×104+6.66×106x,相關(guān)系數(shù)r=0.93677;峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.54×105+5.87×107x,相關(guān)系數(shù)r=0.99128.

2.4.2 撲爾敏對(duì)映體分離的精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一撲爾敏對(duì)照品溶液(0.016 mg/mL)在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定峰高和峰面積,結(jié)果見表2.

表2 撲爾敏對(duì)照品精密度測(cè)定結(jié)果(n=5)Tab.2 Results of chlorpheniram ine standard precision determ ination(n=5)

2.4.3 不同生產(chǎn)廠家撲爾敏樣品的分離分析

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,分別選取2種不同廠家生產(chǎn)的撲爾敏樣品進(jìn)行分析對(duì)比.分析結(jié)果見表3.由表3可知:2個(gè)不同廠家生產(chǎn)的撲爾敏片在此條件下,對(duì)映體均達(dá)到基線分離,其分離度分別為10.641和10.696.

表3 不同廠家生產(chǎn)的撲爾敏樣的分離Tab.3 Enantiomeric separation of different manufacturers′chlorpheniram ine

3 結(jié)語(yǔ)

以未涂層融硅石英毛細(xì)管柱(75μm)、pH 2.5、T ris-磷酸緩沖液濃度40 mmol/L、分離電壓25 kV、進(jìn)樣時(shí)間1 m in、檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm 、溫度 20℃ 為HPCE的最佳分離條件,建立了撲爾敏對(duì)映體拆分的高效毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法.對(duì)緩沖溶液的濃度、pH、分離電壓及拆分效果的影響進(jìn)行了討論.并得到撲爾敏分離線性范圍為0.001～0.10 mg/mL.采用HPCE測(cè)定撲爾敏各對(duì)映體的精密度,5次進(jìn)樣的前峰峰高、峰面積RSD分別為7.97%和8.29%,后峰峰高、峰面積RSD分別為9.15%和9.08%.同時(shí)分離了不同生產(chǎn)廠家的撲爾敏樣品,均可得到分離度大于10的分離.本方法用于分離測(cè)定撲爾敏對(duì)映體,簡(jiǎn)便易行,結(jié)果穩(wěn)定,可靠.

[1] 王世玉.世界手性藥物選集[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,1998:242-243.

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A S implif ied High Performance Capillary Electrophoresis Separation and Determ ination of Chlorphen iram ine Enantiomers

S hen J ing ru1,L in M in1,Yu X uehong2,H e B enrong1
(1 Key L aboratory of A nalytical Chem istry of the State Ethnic A ffair Comm ission,College of Chem istry andM aterial Science,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China;2 Hospital,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

A s imple method of enantiomorph separation and determ ination of chlorpheniram ine by high performance capillary electrophoresis was investigated.The chlorpheniram ine enantiomers were well separated in the uncoated fused silica capillary column(75μm)under the follow ing conditions:pH2.5,T ris-phosphate buffer 40 mmol/L,separation voltage of 25 kV,20℃,injection t ime is 1 m in,detection wavelengthλof 214 nm.A good linear relationship was obtained between the peak height or peak area and chlorpheniram ine racemoid concentration the range of 0.001～0.10 mg/mL,the linear relationship coefficients(r)of peak areas is 0.99883 and 0.99128 for the first and second repectively and the relative standard deviations RSD(5 t imes)of the first peak height and peak area is 7.97%and 8.29%.

high performance capillary electrophoresis(HPCE);separation;determ ination;chlorpheniram ine enantiomers

O 652.63;O 641.6

A

1672-4321(2011)01-0025-04

2010-11-10

沈靜茹(1966-),女,教授,研究方向:分離分析,E-mail:shenjingru519@hotmail.com

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(95J60)