李守明,梁維,魏凌基,齊軍倉,王金玲

(1石河子大學農學院,石河子832003;2新疆農業(yè)職業(yè)技術學院,昌吉831100)

利用兩種電泳技術分析大麥品種的醇溶蛋白差異及親緣關系

李守明1,梁維1,魏凌基1,齊軍倉1,王金玲2

(1石河子大學農學院,石河子832003;2新疆農業(yè)職業(yè)技術學院,昌吉831100)

利用大麥醇溶蛋白電泳鑒定方法了解大麥各品種間的親緣關系,采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對國內18份大麥品種的醇溶蛋白電泳圖譜進行了分析。結果表明:從18個供試大麥品種中分別分離出13條和18條遷移率不同的多態(tài)性醇溶蛋白譜帶。利用各品種在遷移率Rf值不同的譜帶存在的明顯差異,可將供試18個大麥品種區(qū)分開。對醇溶蛋白電泳結果進行聚類分析,結果顯示:18份大麥材料在遺傳距離(GD)0.49處聚為4個大類,這表明醇溶蛋白電泳技術對大麥品種鑒定和親緣關系的評價是一種有效的方法。

大麥;醇溶蛋白;電泳

長期以來,品種真實性和純度的檢測仍以傳統的大田小區(qū)種植為主,通過形態(tài)學標記(農藝性狀)來鑒定。但此法所需周期長、成本高,而且易受環(huán)境因素和檢測人員水平的影響。近年來,生物技術的發(fā)展帶來了快速的品種真實性和純度鑒定技術,如蛋白質電泳和DNA指紋等技術。由于蛋白質電泳技術具有用種量少、鑒定時間短、結果穩(wěn)定、重復性高、技術簡單、費用低廉等優(yōu)點而被廣泛用于品種鑒定[1]。蛋白質電泳鑒定技術是一種根據作物品種基因型差異進行品種真實性和純度鑒定的快速而有效的方法。Gilliand[2]首先將蛋白質電泳技術應用于植物品種鑒定。30多年來,醇溶蛋白質電泳技術、酸溶蛋白質電泳技術、鹽溶蛋白質電泳技術、酯酶同工酶電泳技術等技術先后出現,并在應用于水稻、玉米、蔬菜、雜交油菜種子的純度鑒定試驗中,均有成功的報道。

大麥是當今世界最重要的糧食、飼料及食品加工作物之一。醇溶蛋白是麥類作物種子胚乳中主要的貯藏蛋白質之一,與品種的遺傳特性密切相關,其具有穩(wěn)定的遺傳性,一般不受種植環(huán)境的影響。因此,建立麥類作物種子醇溶蛋白的電泳圖譜,就成為品種鑒定及遺傳學分析的重要內容。Cooke等[3]利用ISTA標準對191個不同來源的大麥進行鑒定并將其分為41個不同群體。Stegemann等[4]利用醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)對小麥、大麥、燕麥、黑麥等數種禾谷類植物進行了品種鑒定分析。顏啟傳等[5]使用ISTA推薦的種子醇溶蛋白電泳方法對88個大麥不同品種進行鑒定,認為其圖譜差異的大小可作為品種間親緣關系遠近的一項預測指標。林艷等[6]利用大麥種子醇溶蛋白十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PA GE)鑒定加拿大啤酒大麥的品種和純度。本研究采用APAGE和SDS-PAGE對國內18份大麥品種的醇溶蛋白電泳圖譜進行了分析,旨在說明醇溶蛋白電泳技術對大麥品種鑒定和親緣關系的評價是一種準確、有效、快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為來自我國不同省份的18個大麥品種,由石河子大學農學院作物遺傳育種教研室提供。供試大麥材料的序號、名稱和原產地見表1。

表1 材料的序號、名稱和原產地Tab.1 Name and the origin of experimental materials

1.2 方法

1.2.1 醇溶蛋白提取

將單個大麥籽粒粉碎后置于1.5 mL離心管中,加入400μL提取液(稱取0.05 g甲基紫,溶入25 mL 2-氯乙醇,蒸餾水定容至100 mL),室溫下振蕩30 min,4℃提取,過夜,用前高速離心(12000 r/min)10 min,取上清液進行電泳。

1.2.2 醇溶蛋白A-PAGE電泳

參照文獻[7]中的A-PA GE方法,采用酸性聚丙烯酰胺凝膠 ,含 8.2%Acr、0.34%Bis、0.1% 抗壞血酸、6%尿素、0.001%硫酸亞鐵、0.001%H2O2,以0.4%乙酸和0.04%甘氨酸為電極緩沖液,上樣12 L,再以0.4%乙酸和0.04%甘氨酸為電極緩沖液,上樣,500 V恒壓下掛冰盒電泳。電泳結束后,將膠小心剝出,置于染色液中染色(0.04%考馬斯亮藍、12%三氯乙酸溶液)。用10%三氯乙酸固定,過夜,考馬斯亮藍、甲醇、冰醋酸混合液染色30 min,甲醇、冰醋酸混合液脫色1 d。

1.2.3 醇溶蛋白SDS-PAGE電泳

采用不連續(xù)分離系統。堆積膠緩沖液 1.0 mol/L Tris-HCl,p H 6.8;分離膠1.0 mol/L Tris-HCl,p H 8.8;采用p H 8.3電極緩沖液。電泳結束后,將膠小心剝出并置于染色液(0.04%考馬斯亮藍、12%三氯乙酸溶液)中,染色過夜,最后用甲醇、冰醋酸混合液脫色1 d。

1.2.4 數據處理與統計分析

參照文獻[8]中的方法,計算每個品種蛋白帶的Rf值,相同 Rf值位置上有蛋白帶記為1,無蛋白帶記為0。并根據譜帶顏色和帶型差異將所有條帶分為著色最深,帶型最寬的為1a帶;著色較淺,帶型中等的為1b帶;只有模糊的痕跡帶為1c帶。采用“0、1”系統記錄蛋白譜帶,同一 Rf值位置上有蛋白帶記為1,無蛋白帶記為0,建立醇溶蛋白譜帶數據庫。

用DPS軟件,根據品種間的遺傳距離值[9]以不加權成對算術平均法(UPGMA)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 醇溶蛋白A-PAGE譜帶的多態(tài)性

電泳結果(圖1a)表明,18個供試大麥品種共分離出13種相對遷移率不同的醇溶蛋白譜帶。供試大麥品種譜帶數目不同,最少的5條,最多的11條,平均每個大麥品種分離出7.2條譜帶。在13種相對遷移率不同位置上只有1條共有譜帶存在,而18個大麥品種在12個等位變異位點上均存在多態(tài)性。平均每個品種分離出0.66條多態(tài)性譜帶,這表明這些品種有豐富的多態(tài)性。

2.2 醇溶蛋白SDS-PAGE譜帶的多態(tài)性

離出18種相對遷移率不同的醇溶蛋白譜帶。供試大麥品種譜帶數目不同,最少的6條,最多的16條,平均每個大麥品種分離出13.6條譜帶。在18種相對遷移率不同位置上有2條共有譜帶存在,在16個等位變異位點上均存在多態(tài)性。平均每個品種分離出0.66條多態(tài)性譜帶,這表明這些品種具有豐富的多態(tài)性。

電泳結果(圖1b)表明,18個供試大麥品種共分

圖1 18個大麥品種的醇溶蛋白電泳圖譜Fig.1 A-PAGE SDS-PAGE electrophoresis patterns of Hordein

2.3 醇溶蛋白A-PAGE譜帶的差異

從表2可以看出,在A-PAGE所得的醇溶蛋白電泳圖譜中,共出現13條帶,其中相同條帶只有1條,即在 Rf=0.257的條帶為每個品種所共有。Rf值在0.232～0.900中的條帶在18個品種間的分布有一定差異,例如 Rf=0.232的條帶只有在 G23、哈密大麥、Ca23、紅日啤 2號、廣麥 6號、翼農 0656中出現,而其它品種在該位置上缺失。Rf=0.261的條帶只有廣麥2號、廣麥8號缺失,而其它品種在該位置上均有帶出現。Rf值在0.232～0.290的條帶較為清晰,但是品種間差異不明顯,Rf值在0.290～0.565的條帶較少且比較模糊。Rf值在0.565～0.812的條帶較多且較清晰,可以比較容易辨別條帶的差異。

表2 大麥品種醇溶蛋白A-PAGE譜帶的 Rf值Tab.2 Rfvalue of hordein A-PAGE electrophoresis patterns of 18 barley cultivars

2.4 醇溶蛋白SDS-PAGE譜帶的差異

從表3可以看出,在SDS-PAGE所得的醇溶蛋白電泳圖譜中,共出現18條帶,其中相同條帶有2條:在 Rf=0.55的條帶和 Rf=0.89的條帶為每個品種所共有。Rf值在0.12～0.93的條帶在18個品種間的分布有一定差異。Rf=0.12的條帶只有在G23缺失,而其它品種在該位置上均無該條帶。Rf=0.16的條帶只在新啤1號、新啤2號、昭蘇6棱、甘啤3號、甘啤4號和吉啤1號中出現,其它品種在該位置上均無該條帶。Rf=0.24的條帶在廣麥2號和廣麥6號中缺失,但在其它品種中均存在該譜帶。Rf=0.51的譜帶在吉啤2號缺失,而其它品種均有該譜帶。

表3 大麥品種醇溶蛋白SDS-PAGE譜帶的 Rf值Tab.3 Rfvalue of hordein SDS-PAGE electrophoresis patterns of 18 barley cultivars

2.5 SDS-PAGE和A-PAGE電泳圖譜的比較

利用SDS-PAGE和A-PAGE對18個大麥品種進行分析,均能較強地反映供試品種的醇溶蛋白多態(tài)性,分別分離出18條和13條多態(tài)性譜帶,不同品種間醇溶蛋白圖譜存在明顯差異。在本研究中采用這兩種方法無法將參試的18個大麥品種區(qū)分開(表2、表3)。由兩種方法的比較結果可以看出,SDS-PAGE蛋白電泳圖譜多態(tài)性較強,圖譜差異性更為明顯。

2.6 18個大麥品種醇溶蛋白的聚類

采用聚類分析的方法對供試材料的醇溶蛋白電泳結果進行了分析(圖2)。在閥值0.49處可將供試材料分為4個大類群,8個亞類。第I類群分為2個亞類,有新啤1號、新啤2號、塔城2棱和翼農0656等4個品種;第II類群分為3個亞類,有昭蘇6棱、E2、甘啤 3號、甘啤4號、94啤鑒 131和吉啤 1號等6個品種。第III類群分為3個亞類,有紅日啤2號、廣麥2號、廣麥6號、吉啤2號和廣麥8號等6個品種;第IV類群分為2個亞類,有哈密大麥、G23和Ca23等3個品種。

圖2 供試材料醇溶蛋白的遺傳距離聚類圖Fig.2 Cluster diagram of Hordein G D of provided materials

3 討論

目前,利用蛋白質電泳鑒定品種的方法較多,主要分為酸性和堿性兩大體系。鹽溶蛋白 SDSPAGE以及醇溶蛋白A-PAGE因其具有豐富的多態(tài)性已被廣泛用于品種鑒定、品質分析和種質資源篩選[10-11]。超薄等電聚焦電泳和不連續(xù)醋酸尿素聚丙烯酰胺電泳也有一定的應用。目前,貯藏蛋白電泳技術在不斷地改進和完善,并廣泛應用于小麥、玉米、大麥、棉花、辣椒、向日葵、水稻等作物的品種鑒定?，F在由于計算機技術的發(fā)展,可以利用軟件系統建立大麥品種醇溶蛋白譜帶庫,為今后品種鑒定提供標準參考物。

對醇溶蛋白帶型相同的品種,可以推測其親緣關系較近,但由于大麥籽粒醇溶蛋白含量受到環(huán)境變異和生態(tài)條件的影響[12-13],因而不能簡單地認為這些品種在所有性狀上無差異或者把譜帶相同的品種混為同一品種。因此,還需借助其它蛋白質電泳手段或分子遺傳標記對這些品種進一步加以區(qū)分。

4 結論

1)采用SDS-PAGE和A-PA GE兩種方法均可以將參試的18個大麥品種區(qū)分開,并對18個大麥品種進行分析,均能較強地反映供試品種的醇溶蛋白多態(tài)性,不同品種間醇溶蛋白圖譜有明顯差異。

2)SDS-PAGE蛋白電泳圖譜多態(tài)性較強,圖譜差異性更為明顯。

3)18個大麥品種可分為4個大類。將遺傳關系相近的品種聚為一類,例如新啤1號和新啤2號均由野洲2條為父本雜交選育而成。甘啤3號、甘啤4號為一個大類,其中甘啤3號是以法瓦維特為父本,而甘啤4號是以法瓦維特為母本雜交育成的,因而具有較近的親緣關系。

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Difference and Relation between Two Hordein of
Barley Cultivars by Electrophoresis

LI Shouming,LIANG Wei,WEI Lingji,QI Juncang,WANGJinling
(1 College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Xinjiang Agricultural Vocational Technical College,Changji 831100,China)

In order to investigate the difference and relation of two hordein of different barley cultivars by electrophoresis,18 barley cultivars was analyzed by acidicpoly acrylamide gel electrophoresis and sodium dodecyl sulfate-olyacrylamide gel electrophoresis.The results showed that a total 13 and 18 hordein bands with relatively different migration rates was identified in these materials.The findings suggested that the hordein patterns in different barley cultivars differed greatly.Hordein bands with differentRfvalues were so obviously different that the 18 barley cultivars could be easily distinguished.Cluster analysis showed that the 18 barley cultivars could be classified into 4 groups at the level of genetic distance 0.49.The conclusion is that hordein electrophoresis is a feasible method for barley cultivars identification and relation evaluation.

barley;hordein;electrophoresis

S635.1 < class="emphasis_bold">文獻標識碼:A

A

2009-11-16

農業(yè)部948項目(2006-G9-6)

李守明(1977-),男,農藝師,碩士生,專業(yè)方向為生物技術在遺傳育種;e-mail:lishouming@stu.shzu.edu.cn。

魏凌基(1955-),女,教授,從事生物技術在遺傳育種中的應用研究;e-mail:wlj_agr@shzu.edu.cn。