李芳秋， 張士新， 葛玉卿， 劉 群， 張 帆， 盧光明

1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002;

2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，南京 210002；

3.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，南京 210096

抗人精子蛋白17磁性納米探針靶向的卵巢癌體內(nèi)外磁共振成像

李芳秋1， 張士新1， 葛玉卿3， 劉 群1， 張 帆2， 盧光明2

1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002;

2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，南京 210002；

3.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，南京 210096

用MRI（magnetic resonance imaging）技術(shù)探索連接抗人精子蛋白 17單克隆抗體（anti-Sp17 mAb）的磁性納米探針對(duì)體外培養(yǎng)及動(dòng)物體內(nèi)Sp17+卵巢癌的靶向性。將anti-Sp17 mAb連接到表面包覆殼聚糖的超順磁性氧化鐵納米顆粒上，制成磁性納米探針anti-Sp17-MNP，用作MRI陰性對(duì)比劑。將磁性納米探針與Sp17+和Sp17－培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞共育，進(jìn)行一系列體外磁共振成像實(shí)驗(yàn)。荷瘤小鼠尾靜脈注射磁性納米顆粒，用7T磁共振儀在體成像，觀察腫瘤部位的信號(hào)變化，并用普魯士藍(lán)染色腫瘤組織切片，觀察有無(wú)鐵粒子聚集。體外MRI數(shù)據(jù)顯示，anti-Sp17-MNP與細(xì)胞靶向結(jié)合，并與細(xì)胞共育2 h后，Sp17+HO-8910的T2*信號(hào)強(qiáng)度比Sp17-HepG2低2倍；anti-Sp17-MNP對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向作用可被重組人Sp17阻斷。7T磁共振儀對(duì)動(dòng)物在體腫瘤成像結(jié)果顯示，感興趣區(qū)因磁性納米探針靶向聚集而導(dǎo)致信號(hào)降低，并經(jīng)組織切片普魯士藍(lán)染色證實(shí)。本研究結(jié)果表明，用anti-Sp17抗體和新的合成路線制備的納米探針具有用作MR對(duì)比劑進(jìn)行分子成像的潛能。

磁性納米探針；磁共振成像；精子蛋白17；卵巢癌

引 言

應(yīng)用磁共振成像 (magnetic resonance imaging，MRI)對(duì)體內(nèi)腫瘤進(jìn)行早期無(wú)創(chuàng)檢查，需要高敏感的對(duì)比劑[1～3]。具有理想性能的磁性納米探針是實(shí)現(xiàn)疾病檢測(cè)和診斷的關(guān)鍵因素，這些性能包括磁性?xún)?nèi)核的晶體結(jié)構(gòu)[4]與大小[5]、表面特征[6,7]，以及是否偶聯(lián)特異性靶向生物分子[8～11]。這些性能決定了磁性納米探針的循環(huán)半衰期、調(diào)理作用、生物動(dòng)力學(xué)，及其在體內(nèi)的分布[2]。這些探針可通過(guò)特異性生物學(xué)反應(yīng)，如抗原-抗體反應(yīng)、核酸雜交，識(shí)別相應(yīng)靶標(biāo)。然而，改善靶向于腫瘤病變及其微環(huán)境的治療或成像制劑的任務(wù)仍然艱巨[12]。

超順磁性氧化鐵納米顆粒 (superparamagnetic iron oxide nanoparticle，SPION)在生物體內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，可用做T2和 T2*-weighted MR[2,13]對(duì)比劑。而磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNPs)易于被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) (reticuloendothelial system，RES)攝取，嚴(yán)重影響其靶向特異性。

精子蛋白17(sperm protein 17，Sp17)正常表達(dá)于人睪丸中的精母細(xì)胞、精子細(xì)胞以及成熟精子中，在多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌等惡性腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)[14]。它被候選為腫瘤免疫治療和分子診斷的新靶標(biāo)。

本研究嘗試用殼聚糖 (chitosan，CS)包覆的SPION偶聯(lián)抗人Sp17(anti-Sp17)，制成Sp17+腫瘤特異性探針，增強(qiáng)其特異性結(jié)合于腫瘤部位的活性，有望提高探測(cè)腫瘤的敏感性和特異性。

材料和方法

材料與儀器

抗人Sp17單克隆抗體 (mAb)和重組人Sp17由本室制備[15]；殼聚糖磁性納米顆粒由東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程系制備貯存；高表達(dá)Sp17+卵巢癌細(xì)胞系HO-8910和Sp17-細(xì)胞系HepG2均由本實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c裸鼠購(gòu)自南京軍區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科。1.5T磁共振成像儀 (Eclipse，Philips Medical Systems，Netherlands)和7T小動(dòng)物磁共振成像儀(BrukerBioSpin MRI Gmb H，German)系東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院所有。

方法

抗Sp17免疫磁性納米顆粒的制備

利用化學(xué)偶聯(lián)劑制備免疫磁性納米顆粒的方法同前報(bào)道[16]。將殼聚糖包覆的磁性納米顆粒用雙蒸水磁分離洗滌3遍后，用1 ml 2-(N-嗎啉基)乙磺酸 〔(2-N-morpholine)-ethane sulphonic acid，MES〕緩沖液 (0.1 mol/L，pH 4.7)重懸并超聲分散，然后加入適量的經(jīng)過(guò)EDC/NHS活化的anti-Sp17，混勻，室溫下輕輕搖動(dòng)2 h。將混合物用PBS緩沖液磁分離洗滌3次，以除去游離抗體，然后將磁性納米顆粒重懸于含10 g/L PEG-COOH的PBS溶液中，室溫振蕩2 h。同樣進(jìn)行磁分離洗滌除去游離分子，最后重懸于等體積的PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)中，即制成anti-Sp17-MNP免疫磁性納米顆粒。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抗Sp17免疫磁性納米顆粒的形貌和磁學(xué)性質(zhì)表征

將偶聯(lián)顆粒滴在300目的銅網(wǎng)上，透射電子顯微鏡下觀察顆粒的形貌。采用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)表征其磁性。

細(xì)胞培養(yǎng)與MR體外成像

高表達(dá)Sp17的 Sp17+HO-8910細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)基因轉(zhuǎn)染得到[17]。HepG2(Sp17-腫瘤細(xì)胞系)由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供。兩種細(xì)胞都培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)的Sp17+HO-8910和HepG2細(xì)胞分別與anti-Sp17-MNP或MNP共孵育不同時(shí)間，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)空白細(xì)胞對(duì)照。磁性顆粒加入量為20 μg，孵育時(shí)間分別為2 h和16 h。另將IMNPs與重組人Sp17蛋白混勻后作用2 h，作為抑制對(duì)照組。用PBS徹底清洗后，用胰蛋白酶消化分散細(xì)胞，重懸于含0.5 ml 10 g/L瓊脂糖的Eppendorf管中。隨后采用 1.5T MR儀進(jìn)行磁共振檢測(cè)。表面線圈內(nèi)徑為12.7 cm。T1W成像序列參數(shù)為：TR 500 ms，TE 17.9 ms；T2W參數(shù)為：TR 4000 ms，TE 108 ms，echo train length 16；T2*W為梯度回波序列：TE 15.7 ms，反轉(zhuǎn)角35°，矩陣256×256，層厚2 mm，視野10 cm×10 cm，激勵(lì)次數(shù)2～4，測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度 (signal intensity，SI)的感興趣區(qū) (region of interest，ROI)為20 mm2。腫瘤動(dòng)物模型建立與MR體內(nèi)成像

Sp17+HO-8910細(xì)胞 (2×106/0.2 mL·只)皮下注射于雌性裸鼠肩背部，等腫瘤長(zhǎng)至約0.8～1.5 cm大小時(shí)，以3 mgFe/kg體重、經(jīng)尾靜脈注射anti-Sp17-MNP探針 (n=3)和無(wú)抗體的MNP(n=3)。采用7T MR儀，對(duì)小鼠腫瘤部位進(jìn)行斷層掃描，掃描時(shí)間為注射前及注射后1、2、2.5、4和6h。掃描參數(shù)如下：TR 3000ms，TE 40ms，視野40mm×40mm，矩陣256×256，層厚1.0 mm，回波鏈8,激勵(lì)次數(shù)3，反轉(zhuǎn)角180°。 感興趣區(qū)設(shè)為20 mm2。用系統(tǒng)軟件計(jì)算T2的相對(duì)值△T2，計(jì)算公式為：(T2pre-T2post)/T2post×100，式中T2pre和T2post分別是注射前后的T2值。

普魯士藍(lán)染色

注射納米探針及對(duì)照納米顆粒后2 h，處死小鼠，取腫瘤組織制備冰凍切片，95%酒精固定10 min，用PBS反復(fù)沖洗，之后滴加10%亞鐵氰化鉀和2%鹽酸的混合物，37℃孵育30 min，PBS沖洗，最后中性紅復(fù)染，透明后封片，于顯微鏡下觀察藍(lán)染部位。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每種試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值±SD，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

抗Sp17免疫磁性納米顆粒的表征

采用TEM觀察免疫磁性納米顆粒的形貌，可見(jiàn)免疫磁性納米顆粒為類(lèi)球形，其平均粒徑約10 nm。室溫下，免疫磁性納米顆粒的磁滯回線如圖1所示，測(cè)定的磁場(chǎng)從-6000到6000 Oe。從圖中可以看出，MNP的飽和磁化強(qiáng)度 (saturation magnetization，Ms)和矯頑力 (coercivity，Hc)分別為 47.03 emu/g和1.5411 Oe，anti-Sp17-MNP的Ms和Hc分別為 34.58 emu/g和 1.54 Oe，VSM(vibrating sample magnetometer)研究顯示出納米顆粒的超順磁性。anti-Sp17-MNP的Ms低于裸磁顆粒，提示顆粒表面存在的無(wú)磁性CS和抗體使得顆粒的Ms降低。

體外MRI檢測(cè)納米探針對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性

圖1 裸MNP和anti-Sp17-MNP的磁化曲線Fig.1 Magnetization curve of naked MNPs and anti-Sp17-MNPs

由于磁性納米顆粒是一種陰性成像對(duì)比劑，所以磁性納米顆粒越多，磁共振掃描圖像越暗，對(duì)應(yīng)的T2*信號(hào)強(qiáng)度值越低。從圖2A中可以看出，與兩個(gè)對(duì)照組相比，Sp17+HO-8910細(xì)胞與anti-Sp17-MNP結(jié)合后，其T2*信號(hào)強(qiáng)度明顯降低；圖2B顯示，隨anti-Sp17-MNP與細(xì)胞共孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞的SI降低。孵育 2 h，Sp17+HO-8910細(xì)胞的 SI比 HepG2低 2倍；孵育時(shí)間增至 16 h，Sp17+HO-8910和HepG2細(xì)胞的SI進(jìn)一步降低，Sp17+HO-8910細(xì)胞比HepG2降低更明顯。此結(jié)果提示，磁性納米探針通過(guò)anti-Sp17靶向有效地結(jié)合于Sp17+HO-8910細(xì)胞。在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中，先用20 μg Sp17 mAb與anti-Sp17-MNP反應(yīng)1 h，再加入Sp17+HO-8910細(xì)胞，從圖2C顯示的結(jié)果可見(jiàn)，孵育時(shí)間為2 h時(shí)，anti-Sp17-MNP對(duì)細(xì)胞的靶向結(jié)合作用幾乎完全被特異性抗體抑制，從而顯示納米探針對(duì)Sp17+HO-8910細(xì)胞結(jié)合的特異性。圖2D顯示anti-Sp17-MNP和無(wú)抗體偶聯(lián)的游離MNP與Sp17+HO-8910細(xì)胞共同孵育的結(jié)果，從圖中可見(jiàn)，沒(méi)有抗體的MNP，與細(xì)胞共同孵育2 h，不能明顯降低SI；孵育時(shí)間增加到16 h，MNP造成了SI顯著降低，但仍然高于anti-Sp17-MNP。

圖2 體外MRI結(jié)果分析 (A)Anti-Sp17-MNPs與Sp17+HO-8910細(xì)胞和HepG2細(xì)胞共育后獲得的MR圖像；(B)比較anti-Sp17-MNP對(duì)Sp17+HO-8910和HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度；(C)重組Sp17對(duì)anti-Sp17-MNP抑制作用；(D)比較anti-Sp17-MNP與無(wú)抗體MNP對(duì)Sp17+HO-8910細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果顯示為T(mén)2*信號(hào)強(qiáng)度(signal intensity，SI)Fig.2 In vitroMR imaging (A)MR image obtained after incubation anti-Sp17-MNPs with Sp17+HO-8910 and HepG2 cells;(B)Comparison adsorption of anti-Sp17-MNPs incubatedwith Sp17+HO-8910 and HepG2 cells;(C)With Sp17+HO-8910 under Sp17 mAb Competition;(D)With Sp17+HO-8910 compared to antibody free MNPs.The results were determined by T2*signal intensity(SI)

模型動(dòng)物體內(nèi)腫瘤MRI

圖3是注射納米顆粒前和注射后1、2、2.5、4和 6 h時(shí)間點(diǎn)獲得的T2W圖像。與注射前的T2W圖像比較，注射anti-Sp17-MNP探針后可見(jiàn)暗區(qū) (圖中白色圓圈標(biāo)示的區(qū)域)。這是納米探針在腫瘤積聚造成的結(jié)果。定量分析顯示，△T2逐漸增加，注射 anti-Sp17-MNP 2 h時(shí)達(dá)到最大值，約8%(圖4)。比較而言，同樣劑量的無(wú)抗體MNP注射于荷瘤小鼠腫瘤部位的T2W圖像無(wú)明顯變化，△T2增加2%。

圖3 注射anti-Sp17-MNP前后在體腫瘤的MRI T2W圖像 注射劑量為3 mg Fe/kg體重。(A)注射前；(B～F)注射后1、2、2.5、4和6 hFig.3 T2-weighted MR images ofin vivo tumoracquired before and afterthe injection of anti-Sp17-MNP The injected dose in both cases was 3 mg Fe/kg body weight of nude mice.(A)Preinjection;(B～F)Postinjection for 1,2,2.5,4 and 6 h

圖4 注射anti-Sp17-MNP和無(wú)抗體MNP后，腫瘤部 位 時(shí) 間 依 賴(lài) 的 △T2 — ■ —：MNPs；— ● —：Anti-Sp17-MNPsFig.4 Time-dependent△T2atthe tumorsite after injection of the anti-Sp17-MNP and antibody free MNP — ■ —:MNPs;— ● —:Anti-Sp17-MNPs

組織切片證實(shí)納米探針在體內(nèi)的靶向功能

為直接觀察腫瘤組織中納米探針的聚集，在MRI信號(hào)降低最顯著的時(shí)間段，即注射納米探針后2 h，取腫瘤組織，用普魯士藍(lán)染色法顯示組織切片內(nèi)的鐵粒子。結(jié)果顯示，在注射劑量和觀察時(shí)間相同的條件下，anti-Sp17-MNP注射的小鼠腫瘤組織藍(lán)色顆粒明顯 (圖5A)，說(shuō)明納米探針通過(guò)靶向作用聚集，而注射MNP的對(duì)照腫瘤組織中幾乎沒(méi)有鐵顆粒聚集 (圖5B)。這些結(jié)果與體內(nèi)MRI結(jié)果一致。

圖5 注射探針后2 h的腫瘤組織切片 普魯士藍(lán)染色 (A)Anti-Sp17-MNP；(B)無(wú)抗體MNPFig.5 Histochemicalanalysis oftumortissue slices after injection for 2 h (A)Anti-Sp17-MNP;(B)Antibody free MNP

討 論

MRI已經(jīng)成為臨床無(wú)創(chuàng)診斷軟組織和軟骨病變的主要手段。為提高敏感性，SPION被選做對(duì)比劑。SPION性能的優(yōu)化可改善其體內(nèi)分布，更適合臨床應(yīng)用。為改善其MR對(duì)比功效，研究者正在對(duì)納米顆粒的大小、磁晶體相、表面狀態(tài)、蛋白吸附活性，以及對(duì)人體的毒性進(jìn)行研究[18～20]。對(duì)顆粒表面進(jìn)行包覆 (如本研究用殼聚糖包覆)，可增加其生物相容性，同時(shí)引入更多特異性的表面生物分子，如抗體、蛋白質(zhì)、肽和小分子靶向配體，將是實(shí)現(xiàn)分子成像的主要策略[21～24]。Sp17局限在人睪丸組織和成熟精子中正常表達(dá)，而在多種惡性腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，因而被候選為腫瘤免疫治療和分子診斷的新靶標(biāo)[14,17,25]。本研究用其特異性抗體制成免疫磁性納米探針，采用體內(nèi)外MRI測(cè)定，考察其對(duì)相應(yīng)腫瘤的靶向性。

磁性納米顆粒在體內(nèi)外都可被細(xì)胞非特異性攝取，從而產(chǎn)生MRI信號(hào)的改變，細(xì)胞與納米顆粒接觸時(shí)間越長(zhǎng)，攝取量越多。本研究通過(guò)一組體外實(shí)驗(yàn)，考察anti-Sp17-MNP靶向Sp17+細(xì)胞的作用。anti-Sp17-MNP分別與Sp17+細(xì)胞和Sp17－細(xì)胞共育結(jié)果表明，MRI信號(hào)降低具有細(xì)胞特異性 (圖2A,B)，anti-Sp17-MNP導(dǎo)致的Sp17+細(xì)胞MRI信號(hào)的變化可以被重組Sp17所阻斷 (圖2C)，anti-Sp17-MNP和無(wú)抗體的MNP同樣與Sp17+細(xì)胞作用，前者可在2 h時(shí)導(dǎo)致MRI信號(hào)明顯下降，而后者在共同孵育16 h后，由于細(xì)胞的非特異攝取，導(dǎo)致信號(hào)明顯下降，但作用仍然較前者弱。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，殼聚糖包覆的MNP有很好的生物相容性，抗體的加入又增加了探針的特異性。

總之，我們嘗試用單克隆抗體制備特異性磁性納米探針，并研究了該探針在體內(nèi)外對(duì)Sp17+腫瘤細(xì)胞的靶向作用，以及作為MRI陰性對(duì)比劑的可行性。結(jié)果表明，所制備的探針具有抗體的免疫反應(yīng)活性和磁性顆粒的超順磁性。其表面偶聯(lián)的抗體可與離體和在體腫瘤細(xì)胞結(jié)合，且沒(méi)有明顯的非特異性吸附。

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In Vitroandin VivoTargeting Magnetic Resonance Imaging for Ovaran Cancer by Anti-Human Sperm Protein 17 Mediated Magnetic Nanoprobes

LI Fangqiu1,ZHANG Shixin1,GE Yuqing3,LIU Qun1,ZHANG Fan2,LU Guangming2
1.Institute of Medical Laboratory Science of PLA,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command,Nanjing 210002,China
2.Department of Medical Image,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command,Nanjing 210002,China
3.Jiangsu Laboratory for Biomaterials and Devices,State Key Laboratory of Bioelectronics,
School of Biological Science and Medical Engineering,Southeast University,Nanjing 210096,China

Communication by editorial board members(LU Guangming)

This work was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China(30670599),Key Program in Medical Science&Technology of Nanjing Military Command during the Eleventh Five-Year Plan Period

Jan 30,2011 Accepted:Mar 12,2011

LI Fangqiu,Tel:+86(25)80863082,E-mail:njlifq@163.com

The aim of this study is to develop a targeting molecular nanoprobe with anti-human sperm protein 17(anti-Sp17)mediated magnetic nanoparticle for prospectively tumor magnetic resonance(MR)imagingin vitroandin vivo.The nanoprobes with anti-Sp17-MNP were prepared by linking anti-human Sp17 monoclonal antibodies on the surface of chitosan coated magnetic nanoparticles(MNPs).A set ofin vitromagnetic resonance imaging experiments were performed afterincubated the immunomagnetic nanoparticles with human sperm protein 17 expressing ovarian cancer cells.The nanoprobes were injected into tail vein of nude mice and monitored the implanted tumor with 7T MR image system.Histologic sections were stained with the mixture of 10% potassium ferrocyanide.Statistical analyseswereperformed by using repeatedmeasuresanalysisof variance.Thedataobtained from in vitroMRI showed that anti-Sp17-MNPswere targeted successfully to the Sp17+cancer cells.When anti-Sp17-MNPs were incubated with cells for 2 h,Sp17+HO-8910 were found to have reduced SI by 2-folds over that of Sp17-HepG2 and this targeting effect could be blocked by recombinant human sperm protein 17.There was clearly detectable accumulation of the nanoprobes in subcutaneous tumor on T2-weighted images after the injection of nanoprobes for 2 h while the insignificant effects after the injection of antibody free MNPs.Histological analyses confirmed the presence of the nanoprobes in the tumor.The results of this research showed that the nanoprobes prepared by the novel synthetic route could potentially be used as MR contrast agents for molecular imaging.

Magnetic nanoprobe;MRI;Sperm protein 17;Ovarian cancer

本文通過(guò)“綠色通道”投稿 (推薦編委：盧光明)

2011-01-30；接受日期：2011-03-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30670599)，南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技“十一五”研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(06Z43)

李芳秋，電話：(025)80863082，E-mail：njlifq@163.com

R445

10.3724/SP.J.1260.2011.00365