鄒青松，陳 山，王 曉，陳 瑋，李素霞，韋艷君

（廣西大學(xué)糖業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530004）

瑤山甜茶可溶性糖的測(cè)定

鄒青松，陳 山*，王 曉，陳 瑋，李素霞，韋艷君

（廣西大學(xué)糖業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530004）

為探明瑤山甜茶中可溶性糖的含量和種類，采用蒽酮—硫酸比色法測(cè)定其可溶性總糖含量，運(yùn)用高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）測(cè)定多糖分子量分布范圍，并利用高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC－ELSD）法在兩種流動(dòng)相體系中測(cè)定和分析其低分子寡糖和單糖的種類與含量。結(jié)果表明，瑤山甜茶中可溶性總糖含量為15.20%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.996%；多糖分子量Mw范圍為51551～55628，RSD為0.64%～1.23%；單糖種類主要為木糖、果糖和葡萄糖，相對(duì)含量分別是0.54%、52.18%和42.76%。

瑤山甜茶，可溶性糖，蒽酮－硫酸法，高效凝膠過濾色譜法（HPGFC），高效液相－蒸發(fā)光散射法（HPLC－ELSD）

瑤山甜茶是多年生落葉帶刺灌木，經(jīng)鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物［1］，廣泛分布于廣西金秀、桂平、藤縣等地區(qū)，學(xué)名Rubus Suavissimus S.Lee，國(guó)外也稱之為Tien cha或Chinese sweet tea，因其葉具有強(qiáng)烈的甜味口感而得名，并在民間入藥用于補(bǔ)腎降壓，被當(dāng)做一種茶而飲用已久。甜茶的主要甜味成分是甜茶甙，約占甜茶干葉重量的5%［2］，質(zhì)量濃度為0.025%時(shí)其甜度是蔗糖的115倍，這使得瑤山甜茶具有優(yōu)良天然甜味劑的品質(zhì)［3－4］。隨著人們生活水平的提高，人口老齡化加劇以及肥胖發(fā)生率的增加，糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)［5］，中國(guó)已確診的糖尿病患者僅城市地區(qū)就高達(dá)4000萬(wàn)，城鄉(xiāng)人群發(fā)病率正以令人擔(dān)憂的速度遞增。這使得尋找新的非糖低能量天然甜味劑的問題亟待解決，也為瑤山甜茶提供了潛在的巨大市場(chǎng)。近年來(lái)研究表明，甜茶及其提取物具有抗過敏［6］、抑制糖基轉(zhuǎn)化以及防止肥胖和治療糖尿病等藥效功能，將甜茶用作食品或藥品中的重要成分已有文獻(xiàn)報(bào)道［7－9］。然而，甜茶的甜味物質(zhì)在報(bào)道中多為甜茶甙及其衍生物，甜茶自身的糖類物質(zhì)未見確切報(bào)道。本文利用蒽酮－硫酸比色法測(cè)定瑤山甜茶中可溶性總糖，采用HPGFC法測(cè)定甜茶中多糖含量以及平均分子量分布范圍，利用高效液相色譜法（HPLC－ELSD）測(cè)定瑤山甜茶中的寡糖和單糖種類和含量，為瑤山甜茶這一優(yōu)良的食藥兩用資源的產(chǎn)品深開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜茶干葉 產(chǎn)于廣西金秀大瑤山，經(jīng)粉碎后過40目篩；葡萄糖、果糖、蔗糖 均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)；低聚果糖 由廣西奧立高生物有限公司提供，純度大于99%；系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 重均分子量（Mw）范圍為5900～778，000，Sigma公司；乙腈、乙酸乙酯 均為色譜純，美國(guó)Fisher公司；其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水 超純水。

桌面超濾膜組件 安瑪西亞中國(guó)有限公司；UV－2501PC雙光束紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；高效液相色譜系統(tǒng) Waters－600－ELSD－2000，配Empower軟件系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司；HPLC色譜柱2，大連伊利特公司；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng) 配示差折光檢測(cè)器，Agilent GPC軟件系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司；TSK凝膠柱 日本東洋曹達(dá)公司；HPGFC色譜柱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理［10－12］甜茶干葉經(jīng)石油醚回流提取2h脫脂處理后，風(fēng)干備用。稱取20g處理好的甜茶干葉置于1000mL大燒杯中，按照料液比=1∶30（w/v，g/mL）加入90℃的超純水，并把燒杯迅速置于85℃水浴鍋中，以電動(dòng)攪拌機(jī)300r/min攪拌，20min后趁熱抽濾，重復(fù)浸提一次。提取液經(jīng)活性炭顆粒（2%添加量，70℃水浴搖床，60r/min，30min）脫色，抽濾后得到濾液，取250mL濃縮至約50mL時(shí)用四倍的無(wú)水乙醇做醇沉處理，置于冰箱4℃冷藏室過夜，離心所得沉淀物采用真空冷凍干燥法凍干，得甜茶糖類粉末TPS1。剩余濾液采用截留分子量為10萬(wàn)（MWCO 100kDa）的超濾膜去除蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)和進(jìn)一步脫色，透過液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，同樣進(jìn)行醇沉和真空冷凍干燥處理，得到TPS2。

1.2.2 蒽酮－硫酸法測(cè)定總糖條件［13］準(zhǔn)確稱取經(jīng)石油醚處理過的干葉5g，置于250mL具塞三角瓶中，加沸水50mL，加蓋超聲提取10min后再進(jìn)行85℃水浴提取10min，趁熱抽濾，濾液冷卻后定容與100mL容量瓶中，得提取液。參照文獻(xiàn)［13］，以葡萄糖為對(duì)照觀測(cè)指標(biāo)，采用紫外分光光度法在波長(zhǎng)為620nm處測(cè)定甜茶可溶性總糖。

1.2.3 HPGFC色譜條件［14］色譜柱：TSK4000PW凝膠柱（7.5×300mm），TSK－3000SW 凝膠柱（7.5×300mm），TSK－Guard SW（7.5×75 mm）保護(hù)柱；柱溫：23℃；柱壓：0.262MPa；流動(dòng)相為超純水，超聲脫氣后備用；流速0.8mL/min；進(jìn)樣量：20!L。

精密稱取系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水定容于5mL容量瓶，得到10.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；另分別配制此濃度的TPS1和TPS2溶液。所配溶液先經(jīng)10000r/min高速離心5min，再取上清液經(jīng)0.45!m的濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.4 HPLC色譜條件［15－18］色譜柱：Hypersil ODS NH2（250mm×4.6mm i.d.，5!m），流動(dòng)相流速：1.0mL/min；ELSD－2000條件：漂移管溫度100℃，氮?dú)庾鲚d氣，載氣流速為 2.5L/min。以超純水配制4.0mg/mL的TPS1用于HPLC－ELSD測(cè)定，對(duì)照品糖液濃度為1mg/mL，所配溶液先經(jīng)10000r/min高速離心5min，再取上清液經(jīng)0.45!m的濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

流動(dòng)相體系1：參照文獻(xiàn)［15］和［16］，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，選定流動(dòng)相體系1為乙腈/乙酸乙酯/水=65/25/10（v/v/v），進(jìn)樣量為15!L。

流動(dòng)相體系2：參照文獻(xiàn)［17］和［18］，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，選定流動(dòng)相2為乙腈/水=75/25（v/v），進(jìn)樣量為5!L。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖測(cè)定

蒽酮－硫酸比色法的原理是糖類在高溫下被濃硫酸水解成單糖并迅速衍生成糠醛或羥甲基糖醛后，再與蒽酮結(jié)合成藍(lán)綠色化合物，該物質(zhì)在620nm處有最大紫外吸收峰，并在150!g/mL范圍內(nèi)，其顏色深淺與可溶性糖成正比。而且該法快速方便，在無(wú)需細(xì)分糖類的情況下，可以一次性測(cè)出總量，故本工作采用此法測(cè)定瑤山甜茶中總的可溶性糖。測(cè)定結(jié)果顯示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.007x+0.008（R=0.9978），線性范圍是0～100!g/mL，參照此標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合試樣的吸光值得到瑤山甜茶總可溶性糖為15.20%，其RSD為0.996%（n=3）。

2.2 HPGFC測(cè)定多糖分子量

HPGFC（高效凝膠滲透色譜）是高效液相色譜這一大類中體積排阻色譜法（SEC）的一種，是使用水溶液的凝膠過濾色譜法。HPGFC以分子篩為原理，不同分子量的物質(zhì)通過凝膠柱時(shí)，小分子量物質(zhì)被吸附從而延后被洗出，大分子物質(zhì)則率先被洗出［19］。

選用藍(lán)色葡聚糖，作為測(cè)試大分子多糖保留時(shí)間t0的對(duì)照物，選用葡萄糖作為測(cè)試小分子糖保留時(shí)間tT的對(duì)照物，樣品的保留時(shí)間為tR，若tR居于t0和tT之間，則表明樣品在選用的流動(dòng)相的HPGFC系統(tǒng)中均為選擇性滲透，選用的色譜柱系統(tǒng)無(wú)誤［20］。結(jié)果測(cè)得t0為12.773min，tT為29.952min，所測(cè)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品的保留時(shí)間都在這個(gè)范圍之內(nèi)，表明選用的色譜系統(tǒng)和測(cè)定條件合適。

在1.2.3實(shí)驗(yàn)條件下，Mw在5900～112000之間的葡聚糖的洗脫體積（Ve）和相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值（lgMw）線性關(guān)系良好，擬合曲線方程為 lgMw=－0.124Ve+7.076（r=0.9950），如圖1所示。每一個(gè)樣品分別進(jìn)樣三次，分析樣品的洗脫體積，確定5900～112000間的擬合曲線可以作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用GPC軟件進(jìn)行分析，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，可知TPS1中多糖的Mw為55628，TPS2為51551，RSD為0.64%～1.23%。利用origin 8軟件對(duì)色譜圖進(jìn)行擬合分析，發(fā)現(xiàn)HPGFC測(cè)定數(shù)據(jù)呈較好的正態(tài)分布。

圖1 葡聚糖分子量對(duì)數(shù)值與保留時(shí)間對(duì)應(yīng)關(guān)系

圖2 廣西甜茶糖類物質(zhì)HPGFC色譜圖

2.3 HPLC分析瑤山甜茶小分子糖類

表1 HPLC－ELSD測(cè)定各種糖的色譜圖的分析報(bào)告

趙仁邦［15］等確定了乙腈/乙酸乙酯/水=60/25/15（v/v/v）的流動(dòng)相體系在HPLC－ELSD法中能夠很好地分離出棗的木糖、葡萄糖和果糖等單糖，同時(shí)可以分離出蔗糖；閆建榮［11］等利用乙腈/水 =70/30（v/v）體系在HPLC－ELSD法同時(shí)檢測(cè)到云南甜茶中葡萄糖、蔗糖等8種單糖和二糖。

許秀敏［17］等在流動(dòng)相為乙腈/水=75/25（v/v）的條件下采用HPLC-ELSD法較好地分離了低聚果糖的 1～5糖，Mabel M J［13］等則采用液質(zhì)聯(lián)用（LC－MS）法探明了低聚果糖里面除了1～5糖外，基本沒有其它糖，其單糖是葡萄糖，二糖是蔗糖。

采用的乙腈/乙酸乙酯/水 =65/25/10（v/v/v）體系、乙腈/水=75/25（v/v）體系兩種流動(dòng)相分析瑤山甜茶的小分子糖（包括單糖、二糖至五糖）。

2.3.1 基于流動(dòng)相體系1的HPLC檢測(cè) 采用乙腈/乙酸乙酯/水=65/25/10（v/v/v）體系作為流動(dòng)相，瑤山甜茶提取物中小分子糖的HPLC色譜圖如圖3所示。

圖3 廣西甜茶單糖高效液相分析

2.3.2 基于流動(dòng)相體系2的HPLC分析檢測(cè) 采用乙腈/水=75/25（v/v）流動(dòng)相體系，瑤山甜茶提取物中小分子糖的HPLC色譜圖如圖4所示。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)探索后發(fā)現(xiàn)，該流動(dòng)相體系結(jié)合1.2.4的條件，可以很好地分離低聚果糖的1～5糖，故采用低聚果糖為對(duì)照品，進(jìn)行HPLC分析檢測(cè)。

2.3.3 重現(xiàn)性和分離度測(cè)定 在體系1中以葡萄糖重復(fù)進(jìn)樣三次并測(cè)定其峰面積的方法來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性，在體系2中則用蔗糖來(lái)進(jìn)行重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)測(cè)定果糖峰面積平均值為312454，RSD（n=3）為1.53；蔗糖峰面積為181430，RSD（n=3）為1.25。兩種流動(dòng)相體系中實(shí)驗(yàn)所得色譜圖的特征峰的分析報(bào)告見表1。

圖4 廣西甜茶1～5糖高效液相分析

2.3.4 分析與討論 水提醇沉法是獲得植物性多糖的常用途徑，劉凌等［10］和吳曉鵬等［11］利用此法分別獲得了枸杞多糖和苦丁茶多糖。而活性炭脫色法則是多糖脫色的常用方法，鄭婷婷等［21］利用水提醇沉法得到蘆薈多糖后對(duì)其進(jìn)行了活性炭脫色；在甘蔗制糖領(lǐng)域里，活性炭也被認(rèn)為是一種高效的糖液脫色劑［22］。單糖微溶于乙醇，蔗糖不溶于乙醇，在水中特別是熱水中溶解度非常大。蔗糖在酸性水溶液中極易水解，其速度約為麥芽糖的1000倍［23］。若以得到成分較為單一或分子量較為集中的多糖為目的，一般要在水提醇沉等工藝后會(huì)對(duì)提取物進(jìn)行去除單糖和低聚糖，如柴瑞娟等［24］采用了80%的乙醇5倍回流提取2h去除蕎麥中的單糖和低聚糖。本實(shí)驗(yàn)以探索瑤山甜茶中的各種糖類為目的，故在乙醇沉淀獲得TPS1和TPS2后沒有采取相應(yīng)的工作去除單糖和低聚糖等工作。Koh G Y等［25］利用70%乙醇沉淀得到的瑤山多糖后，采用苯酚－硫酸法直接測(cè)定其含量約為粗提物質(zhì)量的11%，本文用蒽酮－硫酸法得到的結(jié)果是瑤山甜茶中全部的可溶性糖類含量，并且沒有經(jīng)過粗提、醇沉等可能使糖類損失的工藝，所以結(jié)果略大于Koh G Y的結(jié)果。另外，瑤山甜茶熱水浸提溶液的pH經(jīng)測(cè)定在5.6～6.0之間，這也有可能使得本來(lái)含有不多的蔗糖降解成了葡萄糖和果糖。

實(shí)驗(yàn)中采用的色譜條件，基本上滿足了研究的需要，所測(cè)得的目標(biāo)色譜峰分離度良好，測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性亦表現(xiàn)良好。經(jīng)過兩種流動(dòng)相體系的測(cè)定，瑤山甜茶中主要的單糖成分為葡萄糖、果糖和木糖，以面積歸一化法計(jì)算得到果糖占有單糖的52.18%，葡萄糖占42.76%，木糖占0.54%；在本工作的色譜條件下，低聚寡糖中未檢出蔗糖成分。而在所得色譜圖中，還存在0號(hào)和6號(hào)兩個(gè)未知峰，這有待下一步工作繼續(xù)探索，要更為精確地判定瑤山甜茶所含的水溶性糖類成分，LC－MS法將是比較理想的方法。

3 結(jié)論

本文建立了瑤山甜茶可溶性總糖含量、多糖分子量以及低分子糖類種類和含量的測(cè)定方法，檢測(cè)分析了瑤山甜茶干葉中可溶性糖類的種類與含量。實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)中涉及的蒽酮－硫酸比色法、HPGFC、HPLC等實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性較好，可操作性較強(qiáng)。本文建立的系列實(shí)驗(yàn)方法以及實(shí)驗(yàn)思路可以應(yīng)用于其它植物資源的糖類分析。

［1］李樹剛.甜茶，懸鉤子屬一新種［J］.廣西植物，1981（4）：17－19.

［2］Chou G X，Xu S J，Liu D，et al.Quantitative and Fingerprint Analyses of Chinese Sweet Tea Plant（Rubus suavissimus S.Lee）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（3）：1076－1083.

［3］OHTANI K，AIKAWA Y，KASAI R，et al.Minor diterpene glycosides from sweet leaves of Rubus suavissimus［J］.Phytochemistry，1992，31（5）：1553－1559.

［4］Sugimoto N，K Sato，Liu Hong Min，et al.Analysis of rubusoside and related compounds in tenryocha extract sweetener.［J］.Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2002，43（4）：250－253.

［5］陳國(guó)東.糖尿病市場(chǎng)放量可期［N/OL］.醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào)，2008－11－17（A02）［2009－09－26］.http：//www.yyjjb.com.cn/html/2008－11/17/content_80315.htm.

［6］ONO YOSHIKO.Anti－inflammatory and anti－allergic effects of Tien－cha（Rubus suavissimus S.Lee）［J］.Allergy in Practice，2004，317：380－385.

［7］Suntory Ltd.Antiinflammatory agent for food，medicines and cosmetics contains extract of tien cha，Rubus suavissims S.Lee as effective component［P］.Japan：JP9118626－A，1997－05－06.

［8］Yakult Honsha Kk.Glycation inhibitor used as food additive，bathing agent or cosmetic to control e.g.ageing and Alzheimer’s disease，joint disease and kidney disease comprises extract of plant［P］.Japan：JP2004250445－A，2004－09－09.

［9］EHATA MASANAO.Health tea comprises mixture of yacon stem portion， Eleutherococcus senticosus and/or Rubus suavissimus belonging to Rosaceae family of Rubus genus［P］.Japan，JP2003265151－A，2003－09－24.

［10］劉凌，孫慧，周明，等.提取純化工藝對(duì)枸杞多糖抗氧化功能的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（7）：156－159.

［11］吳曉鵬，王一飛，劉秋英，等.苦丁茶多糖的提取分離純化及部分理化性質(zhì)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（6）：141－144.

［12］李超，王俊儒，季曉暉.天麻多糖的分離及其單糖組成分析［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（7）：89－92.

［13］張維杰.糖復(fù)合生化研究技術(shù)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：12－13.

［14］劉麗婭.溶析結(jié)晶輔助膜分離技術(shù)純化藥用右旋糖酐的研究［D］.南寧：廣西大學(xué)，2008：21－22.

［15］趙仁邦，劉孟軍，葛微，等.高效液相色譜法測(cè)定棗中的糖類物質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2004，25（8）：138－142.

［16］閆建榮，楊亞玲，劉謀盛.固相萃取高效液相色譜測(cè)定魚腥草、甜茶中的糖［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，29（4）：404－407.

［17］許秀敏，龍朝陽(yáng)，魯琳，等.HPLC－ELSD法測(cè)定食品中低聚果糖的含量［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（10）：2002－2003.

［18］MabelM J，P T Sangeetha，etal.Physicochemical characterization of fructooligosaccharides and evaluation of their suitability as a potential sweetener for diabetics［J］.Carbohydrate Research，2008，343（1）：56－66.

［19］于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：144－145.

［20］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［M］.2005版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：89.

［21］鄭婷婷，李多偉，張嘉，等.蘆薈中蘆薈多糖提取及脫色工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2005，26（9）：120－121.

［22］霍漢鎮(zhèn)，譚必明.活性炭—高效的糖液脫色劑［J］.廣西輕工業(yè)，2003（3）：16－19.

［23］王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)［M］.第三版.北京：高等教育出版社，2002：15－40.

［24］柴瑞娟，馬加紅，徐的琴.水溶液提取蕎麥水溶性多糖的研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（4）：163－164.

［25］Koh G Y，G X Chou，Liu Z J，et al.Purification of a Water Extract of Chinese Sweet Tea Plant（Rubus suavissimus S.Lee）by Alcohol Precipitation［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（11）：5000－5006.

Determination of the soluble sugar in Rubus Suavissimus S.Lee

ZOU Qing－song，CHEN Shan*，WANG Xiao，CHEN Wei，LI Su－xia，WEI Yan－jun
（Center for Sugar Technology Research，Guangxi University，Nanning 530004，China）

To investigate the content and component of the soluble sugar in R.Suavissimus S.Lee，an anthronesulfuric acid chromatometry method was used to determine total soluble sugar content，and a high performance filter chromatography（HPGFC）was used to determine the molecular of its polysaccharide，and so was high performance liquid chromatography－evaporative light scattering detection（HPLC－ELSD）to determine the component and quantity of the monosaccharide and low－molecular－oligosaccharide.The results showed that the total soluble sugar was 15.2%with RSD of 0.996%，the molecular range was between 51551～55628.Xylose，fructose and glucose was the main monosccharide in R.Suavissimus with a content of 0.54%，52.18%and 42.76%respectively in area normalization method.

Rubus Suavissimus S.Lee；soluble sugar；anthrone－sulfuric acid chromatometry；HPGFC；HPLC－ELSD

TS207.2

A

1002－0306（2011）01－0296－04

2010－01－15 *通訊聯(lián)系人

鄒青松（1983－），男，在讀碩士研究生，研究方向：糖料資源功能研究與綜合利用。

廣西區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（0731051）；廣西區(qū)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（105930903060）。