龐秋芳，彭喜春，歐仕益，吳希陽(yáng)

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632)

直腸菌群對(duì)兩種抗性淀粉的體外發(fā)酵研究

龐秋芳，彭喜春*，歐仕益，吳希陽(yáng)

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632)

分別以兩種抗性淀粉為唯一碳源，對(duì)直腸菌群進(jìn)行體外發(fā)酵。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中兩種培養(yǎng)基的pH呈逐漸下降的趨勢(shì);雙歧桿菌屬、乳桿菌屬的數(shù)量呈上升趨勢(shì);腸球菌屬和腸桿菌屬的數(shù)量也能保持比較穩(wěn)定的數(shù)量，而擬桿菌的數(shù)量在發(fā)酵中后期開(kāi)始減少，但總厭氧菌數(shù)比較穩(wěn)定，因此發(fā)酵過(guò)程中肯定有不同菌屬的生長(zhǎng)演替;兩種碳源均能被腸道菌群利用產(chǎn)生短鏈脂肪酸，其中以丙酸的量最大。乳酸在發(fā)酵過(guò)程中被積累并能快速被一些直腸菌群利用而消耗。

抗性淀粉，體外發(fā)酵，腸道菌群，短鏈脂肪酸

結(jié)腸內(nèi)存在一個(gè)非常復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，含有400多種不同的細(xì)菌種類(lèi)，而腸內(nèi)菌群微生態(tài)的平衡穩(wěn)定對(duì)人體健康有著非常重要的作用。膳食纖維被認(rèn)為對(duì)維持腸道菌群平衡起著重要的作用，而抗性淀粉是膳食纖維中的一種。抗性淀粉［1］(resistant starch，RS)是指不能在健康人體小腸中消化吸收的淀粉及其降解物的總稱(chēng)。RS作為一種新型的膳食纖維資源，其自身直接產(chǎn)生的作用較少，這些功效主要通過(guò)影響其他物質(zhì)的吸收代謝，以及在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生的次生產(chǎn)物而得到發(fā)揮。如RS能夠改變結(jié)腸微生物群落，促進(jìn)腸道有益微生物繁殖，降低腸道pH、減少腐敗物和致癌物的產(chǎn)生、生成B族維生素、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、提高人體免疫力等［2］。由于RS可以“逃逸”小腸消化而到結(jié)腸內(nèi)代謝，因此RS對(duì)腸道的健康意義，特別是在當(dāng)今高脂、高蛋白的飲食模式下，顯得格外重要。本研究分別采用馬鈴薯抗性淀粉和紅薯抗性淀粉兩種可溶性膳食纖維作為唯一碳源，進(jìn)行體外發(fā)酵，觀察在不同發(fā)酵時(shí)間段，RS與人體腸道各菌群生長(zhǎng)數(shù)量及所產(chǎn)生短鏈脂肪酸之間的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)RS在腸道中更為具體的作用，為以后進(jìn)一步研究抗性淀粉的結(jié)腸發(fā)酵作用和健康作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BBL培養(yǎng)基(雙歧桿菌選擇性培養(yǎng))、MRS培養(yǎng)基(乳桿菌選擇性培養(yǎng))、MAC培養(yǎng)基(腸桿菌選擇性培養(yǎng)、KEA培養(yǎng)基(腸球菌選擇性培養(yǎng)) 青島海博生物技術(shù)有限公司;血瓊脂平板 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司;BDS培養(yǎng)基(擬桿菌選擇性培養(yǎng))

按以下配方配制(1L):牛肉粉5.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，Na2HPO44.0g，可溶性淀粉0.5g，葡萄糖 1.5g，L－半胱氨酸 0.2g，膽汁鹽 2.5g，亮綠0.0025g，瓊脂粉15g;不同培養(yǎng)基的具體用途如表1所示;發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基［4］、馬鈴薯抗性淀粉(potatoresistant starch，PRS)、紅薯抗性淀粉(sweet potato resistant starch，SPRS) 自制;乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、乳酸 色譜純，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。

表1 不同培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)目標(biāo)

7.0 L厭氧罐 日本三菱;THZ－98A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;3524－2型CO2培養(yǎng)箱 SHELLAB公司;7890A型氣相色譜儀安捷倫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富集培養(yǎng)基的制備 將上述配好的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(維生素類(lèi)溶液除外)pH調(diào)為6.8，并分裝于總?cè)萘繛?5mL的具刻度離心管中，每管發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基量為46.5mL。分別稱(chēng)取0.55g不同碳源(PRS、SPRS、葡萄糖)，加入到每46.5mL的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，滅菌。按配方［4］將相應(yīng)維生素類(lèi)溶液過(guò)濾除菌后，分別加入到已滅菌的含有不同碳源的培養(yǎng)基中，充分混勻，即得到總發(fā)酵液量為48mL的富集培養(yǎng)基。于4℃放置約12h，使底物(主要是使PRS和SPRS)充分水合。接種前將管置于 37℃ 水浴約30min。

1.2.2 樣品采集及準(zhǔn)備 本研究的樣本來(lái)源于3個(gè)(2男1女)健康成人的糞便。要求:兩個(gè)月內(nèi)未服用抗生素，且無(wú)腸道病史。采集每位實(shí)驗(yàn)者的新鮮自然糞便50g置于密閉的無(wú)菌便盒中，備用。

將50g新鮮糞便用冷蛋白胨水(pH 7.3)500mL稀釋?zhuān)窗?∶10的比例稀釋。加幾粒無(wú)菌玻璃珠渦旋15s使糞粒充分分散開(kāi)來(lái)。稀釋的糞便液用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，并將過(guò)濾得到的糞便懸浮液密封于無(wú)菌器皿中。

1.2.3 直腸菌群的富集培養(yǎng) 將7mL糞便懸浮液加入到48mL發(fā)酵液中，即接種量為13%(發(fā)酵液中分別以PRS、SPRS及葡萄糖作為唯一碳源，另外以不加任何碳源的發(fā)酵液作為空白對(duì)照)，旋緊管蓋，并于37℃厭氧培養(yǎng)。

1.2.4 發(fā)酵液的分段收集及檢測(cè) 在0、4、8、12、24h分別測(cè)上述培養(yǎng)液的pH，并在相應(yīng)的時(shí)間段取不同碳源的發(fā)酵液0.1mL，加入到裝有0.9mL PBS緩沖液(pH 7.4)的EP管中，混勻。然后，以一定的稀釋度將其分別接種于用于選擇性培養(yǎng)雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、腸球菌、腸桿菌和總厭氧菌的BBL、MRS、BDS、KEA、MAC和血瓊脂平板選擇性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時(shí)間后細(xì)胞計(jì)數(shù)。平板接種后剩余發(fā)酵液分裝于各無(wú)菌管中，每15mL發(fā)酵液中加入0.5mL 20g/L CuSO4中止反應(yīng)，并放于－20℃用于 SCFAs等的測(cè)定。

1.2.5 短鏈脂肪酸的測(cè)定［4］取上述存于－20℃的發(fā)酵液，待其解凍后，取2.0mL于一無(wú)菌管中，分別加入0.4mL 50%H2SO4和2.0mL乙醚，混勻，于定軌搖床振蕩混勻45min，再在室溫條件下3000r/min離心5min。取離心后的上清液于滅菌的EP管中，并加入已充分干燥的無(wú)水氯化鈣以去除殘留的水分，之后小心迅速地移取上清液于樣品管，用于GC測(cè)定。

短鏈脂肪酸的測(cè)定采用外標(biāo)法，用乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸和乳酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)器為氫火焰檢測(cè)器(FID);氣相色譜測(cè)定條件:載氣為N2，分流比為10∶1;流速2.0mL/min;用DB－FFAP色譜柱;升溫程序:120℃維持5min，以15℃/min升到250℃保持1min;燃燒爐溫度為280℃，待測(cè)樣品進(jìn)樣量為2μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源發(fā)酵中pH的變化

由圖1可知，以PRS和SPRS為碳源的發(fā)酵液pH的變化趨勢(shì)大致相同，在發(fā)酵過(guò)程中pH不斷下降。其中，以PRS為碳源的發(fā)酵，其pH由0h的7.34發(fā)酵24h后降為4.74，以SPRS為碳源的發(fā)酵pH也由0h的7.33降到了24h的4.87。與陽(yáng)性對(duì)照組葡萄糖比較，葡萄糖下降趨勢(shì)更快，并且發(fā)酵終pH由0h的8.55降為3.75。而無(wú)碳源的陰性對(duì)照組，pH下降趨勢(shì)較平緩，由0h的7.83降為24h的7.23。

圖1 不同碳源發(fā)酵過(guò)程中pH的變化

由上述結(jié)果可看出，葡萄糖是最先能被腸道菌群利用的碳源，PRS和SPRS則次之，但也能在結(jié)腸中發(fā)酵，從而導(dǎo)致不同的pH變化，其代謝產(chǎn)物并能較好地維持腸道酸性環(huán)境。

2.2 發(fā)酵中不同菌群的變化

2.2.1 雙歧桿菌群和乳桿菌的生長(zhǎng)變化 由圖2和圖3可看出，在以PRS和SPRS為碳源發(fā)酵過(guò)程中，雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量均有明顯增加;而以葡萄糖為碳源發(fā)酵4h后，雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量就開(kāi)始明顯減少，可見(jiàn)葡萄糖對(duì)它們的生長(zhǎng)促進(jìn)作用不明顯?？傻贸?，PRS及SPRS作碳源對(duì)雙歧桿菌和乳桿菌的生長(zhǎng)有益，并能促進(jìn)它們?cè)鲋场?/p>

圖2 不同碳源發(fā)酵過(guò)程中雙歧桿菌生長(zhǎng)情況

2.2.2 擬桿菌群、腸球菌及腸桿菌的生長(zhǎng)變化 從圖4～圖6能很明顯地看出，添加葡萄糖的對(duì)照組擬桿菌、腸球菌及腸桿菌三種菌群均在發(fā)酵4、8、10h后數(shù)量開(kāi)始急速下降;而以PRS和SPRS為碳源的12h后三種菌群的數(shù)量才開(kāi)始緩慢減少。其原因可能是葡萄糖在8h前被快速利用，發(fā)酵8h后產(chǎn)生大量SCFAs，pH迅速降為4.03(由圖1可知)，從而抑制了這三種菌群的生長(zhǎng)，當(dāng)然也有可能是由于碳源的缺乏導(dǎo)致。PRS和SPRS為碳源時(shí)，pH在8h前快速下降，10h后下降趨勢(shì)減緩，由于酸性的積累，致使擬桿菌、腸球菌及腸桿菌三種菌群10h后緩慢減少。但總體來(lái)看，PRS和SPRS為碳源發(fā)酵時(shí)，相對(duì)于我們前面對(duì)不溶性膳食纖維的研究而言(另文發(fā)表)，擬桿菌生長(zhǎng)在24h后的數(shù)量稍有減少，而腸球菌及腸桿菌的數(shù)量變化并不顯著;無(wú)糖對(duì)照組菌量的顯著變化的主要原因可能是由于碳源的缺乏導(dǎo)致。

圖3 不同碳源發(fā)酵過(guò)程中乳桿菌生長(zhǎng)情況

圖4 不同碳源發(fā)酵過(guò)程中擬桿菌生長(zhǎng)情況

圖5 不同碳源發(fā)酵過(guò)程中腸球菌生長(zhǎng)情況

圖6 不同碳源發(fā)酵過(guò)程中腸桿菌的生長(zhǎng)情況

2.2.3 總厭氧菌群生長(zhǎng)變化 由圖7可看出，以PRS和SPRS為碳源的兩組，其數(shù)量級(jí)由0h的7.7分別升到發(fā)酵24h后的8.67和8.40，略微有所增加，但總體來(lái)說(shuō)，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中總厭氧菌保持著相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，原因可能是腸道中各菌群對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的競(jìng)爭(zhēng)作用，從而導(dǎo)致各菌群的此消彼長(zhǎng)，最終維持總菌群數(shù)的平衡［5］。而對(duì)照組的葡萄糖與無(wú)碳源組總厭氧菌數(shù)量8h后迅速減少。

圖7 不同碳源發(fā)酵過(guò)程中總厭氧菌的生長(zhǎng)情況

2.3 發(fā)酵中短鏈脂肪酸的變化

2.3.1 短鏈脂肪酸在發(fā)酵中的變化 由圖8～圖9可看出，以PRS為底物發(fā)酵時(shí)，其產(chǎn)生的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸變化趨勢(shì)大致相同;以SPRS為底物發(fā)酵，其產(chǎn)生的四種短鏈脂肪酸(除乳酸)變化也趨于一致，并且兩種底物都隨著發(fā)酵時(shí)間的持續(xù)，短鏈脂肪酸(SCFA)的量總體呈上升趨勢(shì)，從而使腸道pH下降，由此與發(fā)酵中pH變化(圖1)趨勢(shì)相吻合。比較圖8、圖9可發(fā)現(xiàn)，不論是以PRS還是以SPRS作發(fā)酵底物，發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸量最多，丁酸最少。以PRS和SPRS為底物發(fā)酵時(shí)，4～8h乳酸量達(dá)到最大，之后開(kāi)始下降，與圖2、圖3雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量相對(duì)應(yīng)。原因可能是部分直腸菌群(如雙歧桿菌和乳桿菌等)利用PRS、SPRS產(chǎn)生的乳酸可能起到中間產(chǎn)物的作用，為其它腸道菌群的生長(zhǎng)提供能量，如硫酸鹽還原菌［5］，并隨著其它菌群的大量繁殖而減少。

圖8 馬鈴薯抗性淀粉發(fā)酵過(guò)程中SCFAs的變化

圖9 紅薯抗性淀粉發(fā)酵過(guò)程中SCFAs的變化

3 結(jié)論

人體結(jié)腸內(nèi)存在大量的相互制約、平衡生長(zhǎng)的微生物，其中常見(jiàn)的有益菌群為乳酸菌和雙歧桿菌，通過(guò)其菌體本身、分泌物和代謝產(chǎn)物對(duì)腸道健康起著重要的作用，如:抵抗致病菌的侵襲、增強(qiáng)腸道免疫力、營(yíng)養(yǎng)結(jié)腸、預(yù)防結(jié)腸癌等;其它腸道常駐菌有腸桿菌、腸球菌、擬桿菌等，它們一般為條件致病菌。許多因素可影響腸道內(nèi)的微生物，如宿主的年齡、易感性、營(yíng)養(yǎng)需求、免疫狀況、腸道pH、胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間、菌群之間的相互作用以及腸內(nèi)可酵解底物的量和種類(lèi)。在這些因素中，細(xì)菌生長(zhǎng)所需底物的量和類(lèi)型是最具有影響的因素［6］。本研究首次將抗性淀粉、短鏈脂肪酸以及直腸菌群三者的相互關(guān)系聯(lián)系起來(lái)，而不僅是研究抗性淀粉與短鏈脂肪酸之間的關(guān)系。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，不同直腸菌群在兩種RS為碳源發(fā)酵時(shí)，腸球菌、腸桿菌數(shù)量變化不大，而擬桿菌數(shù)量減少，雙歧桿菌及乳桿菌數(shù)量顯著增加，但總厭氧菌等的數(shù)量都能維持比較穩(wěn)定的水平，說(shuō)明RS發(fā)酵過(guò)程中，肯定有不同菌屬生長(zhǎng)的演替，同時(shí)也說(shuō)明RS在一定程度上能維持腸道菌群的平衡。有研究報(bào)道顯示，適量給予RS可以較好地改善腸道動(dòng)力，增加腸道容積，促進(jìn)腸道有益菌的定植［7］，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了RS具有益生的功效(可促進(jìn)有益菌如雙歧桿菌、乳桿菌的增殖)，這與現(xiàn)有的一些文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果是一致的［2－3，6］;由SCFAs的產(chǎn)生引起的pH顯著降低并未導(dǎo)致總厭氧菌的數(shù)量快速下降，因此可能并不是抑制腸道菌群中致病菌生長(zhǎng)的主要原因，這與現(xiàn)有的報(bào)道也不盡相同［8］，但是它與我們前期對(duì)不溶性膳食纖維的研究結(jié)果一致(另文發(fā)表)。

RS在大腸中被結(jié)腸微生物(厭氧菌)發(fā)酵或部分發(fā)酵后，產(chǎn)生揮發(fā)性SCFAs，降低腸道及糞便pH，在主要的3種SCFAs中，以丁酸對(duì)結(jié)腸細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用最強(qiáng)，對(duì)人體結(jié)腸健康方面起著尤為重要的作用［9－11］。SCFAs的種類(lèi)和數(shù)量和pH、微生物菌群及發(fā)酵底物有很大關(guān)系［12］。本實(shí)驗(yàn)證明，RS都能被不同的直腸菌群利用并產(chǎn)生SCFAs，而且該兩種RS被直腸菌群發(fā)酵利用時(shí)，丙酸的產(chǎn)量明顯大于乙酸，這與早期的許多文獻(xiàn)［2，13－14］的報(bào)道認(rèn)為乙酸產(chǎn)量最大的結(jié)果不一致，至于丙酸的產(chǎn)生與腸道菌群的特殊相關(guān)性有待于進(jìn)一步的研究;乳酸可能是直腸菌群發(fā)酵利用RS產(chǎn)生的中間代謝物，能為腸道其它菌群提供能源，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是一致的［5，13，15］。在我們的研究中，丁酸的產(chǎn)量較低，也并沒(méi)有如其它文獻(xiàn)報(bào)道的比其它膳食纖維發(fā)酵所產(chǎn)生的更多［16－17］。

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Study on fermentation of two resistant starch by colon microflora in vitro

PANG Qiu－fang，PENG Xi－chun*，OU Shi－yi，WU Xi－yang
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Potato resistant starch and sweet potato resistant starch were taken respectively as only carbon source to ferment colonic microflora in vitro.The results showed that during the fermentation process in vitro，the pH value of the two culture was gradually decline.In two media with different carbon source，the colonies counts of Bifidobacterium，Lactobacillus showed an upward trend，the number of Enterococcus and Enterobacter remained relatively stable at different fermentation periods，the number of Bacteroides began to reduce in the late of fermentation，and the number of total anaerobic bacterium remained stable.Therefore，the growth succession of different species must be sure in the process of fermentation.The colon microbial could utilize the two carbon sources to produce SCFAs，of which the largest amount was propionate.During the fermentation process lactic acid was accumulated and promptly consumed by colonic microflora.

resistant starch;fermentation in vitro;colonic microflora;short chain fatty acids

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0148－04

2009－12－21 *通訊聯(lián)系人

龐秋芳(1982－)，女，碩士生，研究方向:食品安全。

暨南大學(xué)青年基金(51208029)。