李琳燕

(景德鎮(zhèn)陶瓷學(xué)院體育系，江西景德鎮(zhèn)333001)

過度訓(xùn)練對(duì)大鼠骨骼肌自由基代謝和MAPK信號(hào)通路p38蛋白表達(dá)的影響

李琳燕

(景德鎮(zhèn)陶瓷學(xué)院體育系，江西景德鎮(zhèn)333001)

目的:為探討過度訓(xùn)練的機(jī)制，觀察6周過度訓(xùn)練對(duì)大鼠骨骼肌自由基代謝MAPK信號(hào)通路p38的影響。方法:將30只Wistar大鼠隨機(jī)分成兩組，即安靜對(duì)照組和過度訓(xùn)練組，過度訓(xùn)練組進(jìn)行6周的遞增負(fù)荷過度訓(xùn)練，通過整體機(jī)能狀態(tài)和常規(guī)生化指標(biāo)評(píng)定其運(yùn)動(dòng)疲勞的程度，并進(jìn)一步測(cè)定其骨骼肌丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力及p38蛋白表達(dá)。結(jié)果:過度訓(xùn)練大鼠血清皮質(zhì)醇、睪酮/皮質(zhì)酮和血紅蛋白顯著下降(P＜0.01)，血尿素氮顯著升高(P＜0.01)，且運(yùn)動(dòng)組大鼠睪酮、睪酮皮質(zhì)酮比值、血紅蛋白較正常組分別下降71.81%、85.21%和23.12%，皮質(zhì)酮較正常組升高94.79%，分別超過30%、30%、20%和20%的人類過度訓(xùn)練診斷參考標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，骨骼肌MDA含量明顯升高(P＜0.01)，SOD活性和總抗氧化能力明顯下降(P＜0.05)。肌糖原含量沒有顯著的變化，血糖出現(xiàn)了顯著下降，p38的蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著的升高(P＜0.01)。結(jié)論:過度訓(xùn)練引起的肌能量大量消耗，自由基生成加強(qiáng)，抗氧化能力減弱，過剩的自由基通過p38激活了MAPK系統(tǒng)，但這種激活并沒有增加肌糖原的含量，推測(cè)MAPK對(duì)骨骼肌代謝的調(diào)節(jié)作用可能被低血糖水平所抑制。

過度訓(xùn)練;丙二醛;超氧化物歧化酶;總抗氧化能力;p38蛋白表達(dá)

有關(guān)運(yùn)動(dòng)與自由基的文獻(xiàn)報(bào)道最早見于20世紀(jì)70年代末和80年代初［1－2］。目前普遍認(rèn)為自由基的產(chǎn)生與劇烈運(yùn)動(dòng)即刻或運(yùn)動(dòng)后的許多細(xì)胞、組織、器官水平代謝的紊亂有直接關(guān)系［3－4］。過度訓(xùn)練中，引起機(jī)體運(yùn)動(dòng)源性自由基的生成增加［5－6］。此時(shí)，如果體內(nèi)的抗氧化能力不能同比例增加，將會(huì)產(chǎn)生大量的過剩自由基，它們不僅會(huì)損傷生物膜的功能，也可對(duì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生影響，由此而影響組織能量代謝。

目前研究表明，p38是可以被運(yùn)動(dòng)和肌肉收縮所激活的三條MAPK通路之一。運(yùn)動(dòng)可使骨骼肌中的p38的蛋白表達(dá)和磷酸化水平升高，并推測(cè)p38可能參與運(yùn)動(dòng)激活細(xì)胞肌肉中GLUT－4的蛋白表達(dá)和易位，參與應(yīng)激狀態(tài)下骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取和肌糖原的儲(chǔ)備。而長(zhǎng)期的過度訓(xùn)練對(duì)骨骼肌p38的影響及其與自由基代謝和糖原儲(chǔ)備的關(guān)系，還未見報(bào)道。以此為切入點(diǎn)探討大鼠過度訓(xùn)練對(duì)骨骼肌自由基代謝和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，旨在為揭示過度訓(xùn)練的分子生物學(xué)機(jī)制提供科學(xué)的依據(jù)，也可為探索延緩和消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的方法和手段提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性Wistar大鼠30只，體重200g左右，由沈陽(yáng)市雙義實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào):SCXK(遼)2004－0012，常規(guī)分籠飼養(yǎng)。根據(jù)隨機(jī)設(shè)計(jì)原則，將實(shí)驗(yàn)大鼠按體重隨機(jī)分為兩組，即安靜對(duì)照組(10只)、過度訓(xùn)練組(20只)。

1.2 過度訓(xùn)練方案

各組參照朱全等的過度訓(xùn)練模型［7］，1～3周通過遞增游泳時(shí)間來遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷。第一周:5～30min，第二周30～60min，第三周60～120min;4～6周固定運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加負(fù)重，第四周負(fù)重1%～2%體重，第五周2%～4%體重，第六周4%～6%體重。水池100×60×70cm，水溫(30±2)℃，水深50cm，每只大鼠游泳面積＞300cm2，每周訓(xùn)練6天，休息1天。

1.3 樣品的處理和指標(biāo)測(cè)定

最后一次訓(xùn)練結(jié)束后，隨機(jī)剔除多余大鼠，使每組大鼠均為8只。于實(shí)驗(yàn)前18h禁食不禁水。以10%的烏拉坦溶液按0.8g/kg體重給予麻醉。腹腔靜脈采血。取右側(cè)小腿腓腸肌，準(zhǔn)確稱取一定重量的肌肉(300mg)加4mL 5%三氯乙酸溶液，制成勻漿，3 000r/pm離心5min。吸取上清液，用分光光度法測(cè)定肌糖原含量、總超氧化物歧化酶的活性和丙二醛含量、總抗氧化能力及蛋白含量，用Western Blot方法測(cè)定骨骼肌p38的蛋白表達(dá)。

1.4 數(shù)理統(tǒng)計(jì)法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為方差分析(LSD法和Tamhane’St2)，均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，顯著性水平分P＜0.05和P＜0.01。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 整體狀況觀察

6周遞增負(fù)荷游泳后，與對(duì)照組相比，過度訓(xùn)練組大鼠形體消瘦，神情疲憊，被毛稀疏，脫毛現(xiàn)象嚴(yán)重，有的甚至是露出整塊皮膚，毛色變得晦暗，懶動(dòng)，飲食量減少，大便松軟，有時(shí)便溏。

2.2 一般生化指標(biāo)變化

6周遞增負(fù)荷游泳后，血清皮質(zhì)醇、睪酮/皮質(zhì)酮和血紅蛋白顯著下降(P＜0.01)，血尿素氮顯著升高(P＜0.01)，且運(yùn)動(dòng)組大鼠睪酮、睪酮皮質(zhì)酮比值、血紅蛋白較正常組分別下降71.81%、85.21%和23.12%，皮質(zhì)酮較正常組升高94.79%，分別超過30%、30%、20%和20%的人類過度訓(xùn)練診斷參考標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，運(yùn)動(dòng)組大鼠血尿素氮較正常組升高47.97%。結(jié)合整體狀態(tài)的觀察提示:運(yùn)動(dòng)組大鼠已經(jīng)達(dá)到過度訓(xùn)練狀態(tài)［3］，見表1、表2。

2.3 6周遞增負(fù)荷游泳對(duì)大鼠骨骼肌自由基代謝的影響

與安靜對(duì)照組相比，過度訓(xùn)練組大鼠骨骼肌MDA含量明顯升高(P＜0.01)，SOD活性和總抗氧化能力明顯下降(P＜0.05)。提示:過度訓(xùn)練引起骨骼肌過氧化加強(qiáng)，抗氧化能力減弱，見表3。

表1 6周遞增負(fù)荷游泳后各組大鼠血睪酮、皮質(zhì)酮、睪酮/皮質(zhì)酮值

表2 6周遞增負(fù)荷游泳后各組大鼠血尿素氮(BUN)、血紅蛋白(Hb)值

表3 6周遞增負(fù)荷游泳后各組大鼠骨骼肌自由基代謝的變化

2.4 6周遞增負(fù)荷游泳對(duì)大鼠骨骼肌肌糖原和p38的影響

過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌的肌糖原含量沒有顯著的變化，血糖出現(xiàn)了顯著下降，p38的蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著的升高(P＜0.01)，見表4。

表4 6周遞增負(fù)荷游泳后各組大鼠骨骼肌肌糖原和p38的變化

3 討論

許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)機(jī)體在長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)時(shí)，組織的耗氧量增加，產(chǎn)生自由基的數(shù)量也增加，而機(jī)體內(nèi)抗氧化劑和合成抗氧化酶的微量元素消耗增加，如不能及時(shí)補(bǔ)償，將導(dǎo)致抗氧化能力的下降，清除自由基的能力減弱，造成對(duì)組織細(xì)胞和線粒體等細(xì)胞器的損傷進(jìn)而影響其功能。

細(xì)胞的生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是指細(xì)胞受到胞外的各種刺激后，通過細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子的逐級(jí)傳遞，最終產(chǎn)生一系列細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核生理生化變化的過程，包括對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用［8］。MAPK家族由5種亞類組成:ERK1/2、JNK/SAPK、p38、ERK3/4、ERK5。其中以p38研究最為深入。有研究表明:生長(zhǎng)因子、自由基、細(xì)胞因子、缺氧、胞內(nèi)鈣離子的變化和機(jī)械應(yīng)力等都可以刺激MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)，過度訓(xùn)練是否也會(huì)引起自由基代謝加強(qiáng)進(jìn)而影響MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還未見報(bào)道。

3.1 過度訓(xùn)練對(duì)大鼠骨骼肌自由基代謝的影響

自由基是指具有未配對(duì)電子的原子、離子或分子等類物質(zhì)。機(jī)體在正常生理狀態(tài)下可產(chǎn)生少量的氧自由基，這些自由基可通過相互碰撞而猝滅，或被體內(nèi)的酶促防御系統(tǒng)如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及非酶促防御系統(tǒng)如VitE、VitC等清除，通常不會(huì)造成組織的損傷。但是當(dāng)自由基生成過多，超過了機(jī)體的清除能力，就會(huì)對(duì)生物膜中的不飽和脂肪酸進(jìn)行攻擊，使膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，影響膜的結(jié)構(gòu)和功能。

目前普遍認(rèn)為自由基的產(chǎn)生與劇烈運(yùn)動(dòng)即刻或運(yùn)動(dòng)后的許多細(xì)胞、組織、器官水平代謝的紊亂有直接關(guān)系［9－10］。Reid［11］等利用DCF(細(xì)胞內(nèi)熒光探針技術(shù))技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)隔肌收縮可產(chǎn)生并能夠?qū)OS釋放到肌肉細(xì)胞以外。線粒體是運(yùn)動(dòng)時(shí)ROS產(chǎn)生的主要來源已被多項(xiàng)研究所證實(shí)。Davis［12］等用EPR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)衰竭性運(yùn)動(dòng)大鼠肌肉勻漿中自由基信號(hào)顯著高于安靜對(duì)照組。且自由基是由半醌法來確定的，因此可以推測(cè)檢測(cè)的自由基來自線粒體。Alessio等的研究表明，用巴比妥酸法(TBARS)測(cè)得的脂質(zhì)過氧化與大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷有關(guān)［13］。研究結(jié)果顯示，經(jīng)6周遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷過度訓(xùn)練的大鼠骨骼肌MDA的含量顯著高于對(duì)照組。

細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)包括兩部分，即抗氧化酶和抗氧化劑。在抗氧化酶中超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)對(duì)清除氧自由基最重要的抗氧化酶，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，大量的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。急性運(yùn)動(dòng)后，骨骼?。?4］中SOD的活性增加;長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練也會(huì)使骨骼肌SOD的活性顯著增加，但也有許多研究未檢測(cè)到SOD的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性升高。有報(bào)道大鼠跑臺(tái)訓(xùn)練后，大鼠的大腦皮層和心肌的SOD活性顯著低于對(duì)照組。在研究發(fā)現(xiàn)，過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌中的SOD顯著低于對(duì)照組，總抗氧化能力也同樣低于對(duì)照組。造成運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)SOD的影響結(jié)果一致的原因可能與檢測(cè)SOD活性的技術(shù)、方法不同，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的類型以及負(fù)荷等不同有關(guān)。結(jié)合過度訓(xùn)練對(duì)MDA的影響，提示:過度訓(xùn)練后大鼠骨骼肌自由基生成增加，抗氧化能力下降。

3.2 過度訓(xùn)練脾虛對(duì)大鼠骨骼肌p38的影響

p38MAPK是由360個(gè)氨基酸組成的酪氨酸磷酸化蛋白激酶。它是1993年Brester等在研究高滲環(huán)境對(duì)酵母的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)的，它是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第3種MAPK。引起p38激活的刺激很多，研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激刺激(H2O2、熱休克、高滲環(huán)境、蛋白合成的抑制劑、缺血/再灌注)以及脂多糖(LPS)等均可激活p38通路，其主要參與應(yīng)激條件下細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞調(diào)亡過程。

有研究發(fā)現(xiàn)，70%VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)30min后就會(huì)有p38MAPK磷酸化的升高并持續(xù)60min，運(yùn)動(dòng)激活p38MAPK分子的同時(shí)，也激活下游的信號(hào)分子MAPKAPK 2［15］。在長(zhǎng)時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)后，如馬拉松跑后p38MAPKγ的磷酸化可以升高4倍，但p38MAPKα的磷酸化無(wú)變化［16］。運(yùn)動(dòng)對(duì)p38MAPK途徑級(jí)聯(lián)激活與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)呈正相關(guān)。還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用p38的拮抗劑SB-203580可以明顯降低運(yùn)動(dòng)后骨骼肌對(duì)葡萄糖攝取。其中可能的機(jī)制是p38可能參與運(yùn)動(dòng)激活細(xì)胞肌肉中GLUT－4的蛋白表達(dá)和易位;參與應(yīng)激狀態(tài)下骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取的調(diào)節(jié);p38還能夠提高運(yùn)動(dòng)后骨骼肌對(duì)胰島素的敏感性。

研究結(jié)果顯示，6周遞增大負(fù)荷訓(xùn)練后大鼠骨骼肌中p38活性升高，但并沒有發(fā)現(xiàn)骨骼肌的糖原含量和GLUT4蛋白表達(dá)的升高。提示p38的升高并沒有增加骨骼肌GLUT4的含量和肌糖原的儲(chǔ)備，推測(cè)在過度運(yùn)動(dòng)后的低血糖和胰島素的情況下，p38并沒有影響GLUT4的表達(dá)以及肌糖原的儲(chǔ)備。

有研究表明離體大鼠的骨骼肌中和p38MAPK磷酸化的增加，主要是由于應(yīng)力變化所致;而與收縮相關(guān)的代謝和離子分布的變化，如活性氧產(chǎn)生、較高的機(jī)械應(yīng)力性應(yīng)激對(duì)p38的磷酸化有影響［17］。研究顯示，過度訓(xùn)練后大鼠骨骼肌中的MDA含量升高，SOD和總抗氧化能力下降，推測(cè)可能是運(yùn)動(dòng)引起p38增加的刺激因素。ROS可通過引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化或調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ROS可激活p38MAPK通路，參與靶細(xì)胞損傷過程，在急性炎癥性疾病中起重要作用。這一結(jié)果提示過度訓(xùn)練引發(fā)自由基生成的增加可能是激活p38的主要原因，同時(shí)p38對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)作用被運(yùn)動(dòng)后的低血糖作用所抑制。

4 結(jié)論

過度訓(xùn)練引起的肌糖原大量消耗，自由基生成加強(qiáng)，抗氧化能力減弱，過剩的自由基通過p38激活了MAPK系統(tǒng)，但這種激活并沒有增加肌糖原的含量，推測(cè)MAPK對(duì)骨骼肌代謝的調(diào)節(jié)作用可能被低血糖水平所抑制。

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責(zé)任編輯:喬艷春

Effect of Overtraining on Free Radical Metabolism and Activity of PKB in Rat Skeletal Muscle

LI Linyan
(P．E．Department，Jingdezhen Ceramic Institute，Jingdezhen 333001，Jiangxi，China)

Objective:to investigate the mechanism of overtraining and observe the influence to p38 MAPK on free radical Metabolism of skeletal muscle caused by overtraining for six weeks．Methods:thirty male SD rats were randomly divided into control group without training and overtraining group．The rats in the overtraining groups took incremental over training for 6 weeks;Fatigue was evaluated by overall functional status and conventional biochemical indicators．In the further determination，the MDA，SOD，total antioxidant capacity and the protein expression of p38 were determined．Results:serum cortisol，Testosterone/Corticosterone，Hb of the rats in overtraining group decreased significantly(P＜0.01)，BUN increased significantly(P＜0.01)．Serum cortisol，Testosterone/Corticosterone，Hb in overtraining group is decreased by 71.81%，85.21%and 23.12%respectively．Corticosterone in overtraining group is 94．79%higher than that in the control group．They overtook reference standard for diagnosis of human over-training for 30%，30%，20%，20%．Each MDA in skeletal muscle increased significantly(P＜0.01)，SOD and simultaneously total antioxidant capacity in skeletal muscle decreased significantly(P＜0.05)，simultaneously．Muscle glycogen content did not change significantly，glucose decreased significantly，and the protein expression of p38 increased significantly(P＜0.01)．Conclusion:large amount of energy consumption in skeletal muscle，the increasing of radical generation，the reduced antioxidant capacity，excess radical caused by overtraining activated MAPK，but didn’t increase the content of muscle glycogen．It is speculated that MAPK regulates skeletal muscle metabolic may be inhibited by the low glucose．

over training;MDA;superoxide dismutase;total antioxidant capacity;the protein expression of p38

G804.7

A

1004－0560(2011)01－0062－03

2010-10-25;

2010-11-15

李琳燕(1977－)，女，講師，碩士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生物化學(xué)。