徐正中，陳祥，單鋒麗，孟闖，孫林，黃金林，潘志明，耿士忠，焦新安

揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009

牛γ干擾素的表達(dá)及其抗病毒活性測(cè)定

徐正中*，陳祥*，單鋒麗，孟闖，孫林，黃金林，潘志明，耿士忠，焦新安

揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009

通過RT-PCR從經(jīng)ConA刺激誘導(dǎo)的奶牛脾臟淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出牛γ干擾素 (BoIFN-γ) cDNA，克隆到真核載體 pVAX1中，測(cè)序結(jié)果顯示 pVAX1中的插入序列 BoIFN-γ基因與已報(bào)道序列一致。用重組質(zhì)粒pVAX1-BoIFN-γ轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定，結(jié)果顯示BoIFN-γ在COS-7細(xì)胞中得到成功表達(dá)。將BoIFN-γ基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)、pGEX-6p-1后，分別轉(zhuǎn)化重組表達(dá)菌BL21(DE3)、BL21后，通過對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化，SDS-PAGE分析表明兩種重組蛋白均可實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，大小分別為23 kDa和43 kDa。將含信號(hào)肽BoIFN-γ基因克隆到轉(zhuǎn)座載體 pFastBacTM1中并轉(zhuǎn)化 DH10Bac，通過位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座將 BoIFN-γ基因整合到穿梭載體Bacmid中并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，產(chǎn)生重組桿狀病毒rBac-BoIFN-γ，重組病毒傳代擴(kuò)增感染Sf9細(xì)胞后，通過間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí) BoIFN-γ在桿狀病毒系統(tǒng)中獲得表達(dá)。使用 MDBK/VSV細(xì)胞系統(tǒng)測(cè)定 rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ以及 rBac-BoIFN-γ的抗病毒活性，其效價(jià)分別達(dá)到 8.389×107U/mg、6.554×105U/mg、4.096×104U/mL，3種具有較高的抗病毒活性重組牛γ干擾素的獲得為其開發(fā)應(yīng)用提供了重要的生物材料。同時(shí)使用單克隆抗體5G4和3E6，建立了BoIFN-γ的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，可定量分析BoIFN-γ的抗病毒活性，為其臨床應(yīng)用及相關(guān)研究提供了重要的方法。

牛γ干擾素，大腸桿菌系統(tǒng)，桿狀病毒系統(tǒng)，抗病毒活性，ELISA

Abstract:Bovine interferon-γ (BoIFN-γ) gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) from total RNA of bovine spleen lymphocytes stimulated with ConA. The products of RT-PCR were cloned into pVAX1 vector, positive recombinant clone was identified by restriction enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid pVAX1-BoIFN-γ was transfected into COS-7 cells mediated by lipofectine, indirect immunofluorescent assay analysis confirmed that rBoIFN-γ wasexpressed in COS-7 cells. BoIFN-γ gene (without signal peptide) was cloned into pET-30a(+) and pGEX-6p-1 vector, and transformed into the Escherichia coli cells. After optimizing the induction condition, SDS-PAGE analysis showed that the expression products were all found in soluble form and had a molecular weight of 23 kDa and 43 kDa respectively. BoIFN-γ precursor gene(with signal peptide) was cloned into transfer vector pFastBacTM1, and transformated into DH10Bac E. coli cells. By site-specific transposition, BoIFN-γ gene was integrated into shuttle vector Bacmid, and transfected into the Sf9 insect cells mediated by lipofectine to produce recombinant baculovirus. Indirect immunofluorescent assay analysis confirmed that rBac-BoIFN-γ was expressed successfully in Baculovirus vector system. The antiviral activities of rHis-BoIFN-γ, rGST-BoIFN-γ and rBac-BoIFN-γ were up to 8.389×107U/mg, 6.554×105U/mg and 4.096×104U/mL respectively, which were analyzed in MDBK/VSV system. A sandwich ELISA was established using monoclonal antibodies 3E6 and 5G4, which can detect BoIFN-γ in quantity and provide a useful method for the clinical practice and research of BoIFN-γ.

Keywords:bovine interferon-γ, Escherichia coli, baculovirus vector system, antiviral activity, ELISA

γ干擾素 (IFN-γ) 主要是由有絲分裂原或特異性抗原刺激而活化的CD4+Th1細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及 NK細(xì)胞等產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有廣泛抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫調(diào)節(jié)功能，如活化巨噬細(xì)胞、提高 MHCⅠ類和Ⅱ類分子的表達(dá)、促進(jìn)抗原提呈等，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。研究表明外源性的 IFN-γ既可以作為藥劑用于感染性疾病或腫瘤等的治療，又可以作為免疫佐劑，增強(qiáng)疫苗的免疫效果，還能與一些病原微生物的保護(hù)性抗原基因共表達(dá)，從而加強(qiáng)和改善疫苗的免疫效果；內(nèi)源性 IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，而抗原特異性的 IFN-γ反應(yīng)則可以作為機(jī)體針對(duì)某種特定外來抗原的細(xì)胞免疫狀態(tài)的指標(biāo)。

利用傳統(tǒng)的方法從牛血液中提取和純化BoIFN-γ，過程繁瑣且含量很低，無法滿足實(shí)際使用的需求。1986年，自Cerretti等[2]克隆出牛IFN-γ基因后，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組牛 IFN-γ(rBoIFN-γ) 用于奶牛疾病的防治研究開始興起，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已先后利用大腸桿菌[3]、酵母[4]、牛Ⅰ型皰疹病毒 (BHV-1)[5]、桿狀病毒等系統(tǒng)[6]表達(dá)出重組牛IFN-γ，并對(duì)其免疫學(xué)和生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。但是目前常用的大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的 BoIFN-γ蛋白多以包涵體形式存在，不能進(jìn)行翻譯后修飾等過程，因此其空間結(jié)構(gòu)及生物活性與天然抗原有較大差別，另外內(nèi)毒素也難以去除，因此在臨床應(yīng)用中受到一定程度的限制。干擾素生物學(xué)活性定量分析的研究從干擾素被發(fā)現(xiàn)以來就一直沒有間斷過?？共《痉治龇椒?(Antiviral assay，AVA) 是第一個(gè)建立起來的檢測(cè)IFN樣品相對(duì)活性或效能的生物學(xué)方法?，F(xiàn)有的干擾素生物學(xué)活性鑒定與定量分析方法普遍存在費(fèi)時(shí)、繁瑣、不夠精確、特異性差等一系列缺陷，亟待改進(jìn)。

本研究以伴刀豆蛋白 (ConA) 刺激誘導(dǎo)的奶牛脾臟淋巴細(xì)胞總 RNA為模板，通過 RT-PCR獲得BoIFN-γ基因cDNA，并將其分別克隆至原核和真核表達(dá)載體，以實(shí)現(xiàn)重組 BoIFN-γ蛋白的高效可溶性表達(dá)。同時(shí)使用針對(duì) BoIFN-γ的單克隆抗體[7]建立抗原特異性的雙抗夾心ELISA方法，用于定量分析BoIFN-γ的抗病毒活性，為 BoIFN-γ的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、宿主細(xì)菌、細(xì)胞及病毒

質(zhì)粒載體pGEX-6p-1購(gòu)自Amersham Biosciences公司；pET-30a(+) 購(gòu)自Novagen公司；pFastBacTM1購(gòu)自 GIBCO 公司；大腸桿菌 DH5α、BL21、BL21(DE3) 菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；轉(zhuǎn)座用大腸桿菌DH10Bac (含桿狀病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid和輔助質(zhì)粒Helper) 購(gòu)自Invitrogen公司；草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系9 (Sf9細(xì)胞)、牛腎細(xì)胞系 (MDBK)、野生型桿狀病毒 (wtAcNPV)、水泡性口炎病毒 (VSV) 由本室保存。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基Sf900Ⅱ購(gòu)自GIBCO公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、伴刀豆蛋白 A (ConA) 購(gòu)自 Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自杭州灝洋生物工程公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；高保真DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA回收試劑盒等購(gòu)自 TaKaRa公司；抗BoIFN-γ高免血清、抗 BoIFN-γ單克隆抗體 (5G4和3E6) 由本室制備保存；其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 BoIFN-γ cDNA片段的克隆與鑒定

參照BoIFN-γ cDNA序列 (GenBank Accession No. M29867) 設(shè)計(jì)擴(kuò)增PreBoIFN-γ cDNA的引物：(下劃線部分為 BamHⅠ酶切位點(diǎn))，Pa1：5′-GTACTCGA(下劃線部分為 XhoⅠ酶切位點(diǎn))，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為539 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。按常規(guī)方法進(jìn)行牛脾臟淋巴細(xì)胞的分離、刺激培養(yǎng)及總RNA的提取，兩步法RT-PCR擴(kuò)增BoIFN-γ cDNA基因。

1.4 重組質(zhì)粒pVAX1-PreBoIFN-γ的構(gòu)建及鑒定

將純化回收的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1的相應(yīng)位點(diǎn)之間，參照文獻(xiàn)[8]介紹方法轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pVAX1-PreBoIFN-γ，并將陽性克隆送聯(lián)合基因科技有限公司進(jìn)行 DNA序列測(cè)定。

1.5 重組質(zhì)粒pVAX1-PreBoIFN-γ轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞及間接免疫熒光鑒定

將重組質(zhì)粒 pVAX1-PreBoIFN-γ轉(zhuǎn)染 COS-7細(xì)胞，6% CO2、37 ℃孵育6 h后吸去轉(zhuǎn)染混合物，6%CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h，棄細(xì)胞上清，使用PBS將轉(zhuǎn)染細(xì)胞洗滌3次，用?20 ℃的無水乙醇:丙酮 (2∶3) 混合液室溫固定 5 min，以 1∶500稀釋抗BoIFN-γ高免血清為一抗，以1∶500稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，PBST洗滌后熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 原核重組質(zhì)粒pET-30a-BoIFN-γ、pGEX-6p-1-BoIFN-γ的構(gòu)建及鑒定

以 pVAX1-PreBoIFN-γ為模板，以引物 Ps2：(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，Pa2：5′-TTTGAATTC TTACGTTGATGCTCTCCG-3′ (下劃線部分為 EcoRⅠ酶切位點(diǎn)) 擴(kuò)增不含信號(hào)肽的450 bp成熟BoIFN-γ基因。將純化回收的 BoIFN-γ擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶切后，分別克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(+) 和pGEX-6P-1中，參照文獻(xiàn)[8]介紹的方法轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為 pET-30a-BoIFN-γ、pGEX-6p-1-BoIFN-γ。

1.7 重組菌 BL21(DE3)(pET-30a-BoIFN-γ)、BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ) 的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化

分 別 挑 取 BL21(DE3)(pET-30a-BoIFN-γ)、BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ) 單個(gè)陽性重組菌落于3 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)過夜。次日以 1∶100接種至含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃中振搖培養(yǎng)至OD值為0.4~0.6 (分別培養(yǎng)3~4 h和2.5~3.5 h) 時(shí)，加入IPTG使終濃度分別為0.01 mmol/L和0.05 mmol/L，并分別置于37 ℃和25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4~5 h，離心收集菌體，以滅菌PBS洗滌、懸浮。在冰浴中利用超聲波破碎儀裂解菌體 (800 W超聲10 s，間隔20 s)。依次 6 000 r/min 10 min，8 000 r/min 20 min，8 000 r/min 20 min，9 000 r/min 20 min離心裂解上清。將離心后收集的裂解上清分別使用 His-Bind Purification Kit和Sepharose 4B柱進(jìn)行純化，收集純化融合蛋白rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ，分光光度計(jì)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.8 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFast-BoIFN-γ和重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-BoIFN-γ的構(gòu)建及鑒定

將pVAX1-PreBoIFN-γ經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，克隆到轉(zhuǎn)座載體pFastBacTM1中，參照文獻(xiàn)[8]介紹的方法轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為 pFast-BoIFN-γ；參照文獻(xiàn)[9-10]介紹的方法將重組質(zhì)粒 pFast-BoIFN-γ轉(zhuǎn)化 DH10Bac，通過位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座將 BoIFN-γ基因整合到穿梭載體Bacmid中，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為Bacmid-BoIFN-γ。

1.9 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-BoIFN-γ轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞及間接免疫熒光鑒定

將重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-BoIFN-γ按Bac-to-Bac系統(tǒng)的操作步驟轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)分裂期的Sf9細(xì)胞，5 h后吸去轉(zhuǎn)染混合物，27 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 72 h以上，直至Sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)為止。收集培養(yǎng)上清，避光保存于4 ℃，即為P1代病毒。P1代病毒在Sf9細(xì)胞上經(jīng)2次傳代擴(kuò)增后，即為P3代病毒。將病毒保存液按1∶100體積比感染Sf9昆蟲細(xì)胞，至細(xì)胞病變達(dá)90%時(shí)，棄細(xì)胞上清，使用PBS洗滌，吹干后用預(yù)冷甲醇固定15 min，同時(shí)設(shè)野生型桿狀病毒感染細(xì)胞為陰性對(duì)照；以1∶100稀釋的抗BoIFN-γ單抗 5G4為一抗，以 1∶500稀釋 FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗；PBST洗滌后熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.10 重組BoIFN-γ抗病毒活性測(cè)定

采用微量細(xì)胞病變抑制法，參照文獻(xiàn)[11-12]測(cè)定原核 rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ和真核rBac-BoIFN-γ的抗病毒活性，以每mL (mg) 干擾素樣品的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞 (50%) 免受病毒攻擊的稀釋度的倒數(shù)值定義為1個(gè)干擾素單位 (U)。

1.11 重組BoIFN-γ雙單抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

1.11.1 ELISA操作程序的確定

使用包被液 (碳酸鹽緩沖液，pH 9.6) 稀釋包被單抗5G4，100 μL/孔，置于4 ℃過夜包被；按常規(guī)方法洗滌 (洗滌液：含0.05% Tween-20的PBS，pH 7.4) 和封閉 (封閉液：含1% BSA的洗滌液)；用稀釋液 (稀釋液：含1% BSA、0.05% Tween-20的 PBS，pH 7.4) 稀釋抗原，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h；洗滌 3次，加入稀釋液稀釋的檢測(cè)抗體Biotin-3E6，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h；洗滌 3 次，加入稀釋液 1∶3 000稀釋的 Streptavidin-HRP，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；洗滌3次，加入現(xiàn)配的OPD 100 μL/孔，避光反應(yīng)15 min后，加入終止液(2 mol/L H2SO4) 50 μL/孔，讀取吸光值 (OD492)。

1.11.2 ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

使用包被液將包被抗體稀釋至5、10、20和40 μg/mL，用稀釋液將檢測(cè)抗體作 1∶500、1∶1 000、1∶2 000和1∶4 000稀釋，對(duì)重組BoIFN-γ進(jìn)行檢測(cè)，以確定包被抗體和檢測(cè)抗體的最佳使用濃度，其他步驟均按照1.11.1中ELISA操作程序。

1.11.3 重組BoIFN-γ的定量分析

使用包被液將包被抗體稀釋至10 μg/mL，將重組 BoIFN-γ用稀釋液作倍比稀釋后，每個(gè)稀釋度做2個(gè)復(fù)孔平行加入ELISA板中，以1∶2 000稀釋的生物素標(biāo)記抗體為檢測(cè)抗體，按相同方法進(jìn)行ELISA分析，測(cè)定 OD492值，以抗病毒活性單位為橫坐標(biāo)，OD492值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.12 真核rBac-BoIFN-γ表達(dá)條件的優(yōu)化

將重組桿狀病毒保存液依次進(jìn)行 1∶100、1∶500和1∶1 000體積比稀釋后感染Sf9昆蟲細(xì)胞，并分別于感染后 0、24、48、72、96、120、144、168、192 h吸取上清，通過建立的雙單抗夾心ELISA方法測(cè)定干擾素的抗病毒效價(jià)，確定不同病毒接種量及不同感染時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響，從而選擇最佳的條件進(jìn)行重組蛋白的大量表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 pVAX1-PreBoIFN-γ轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞結(jié)果

通過間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè) PreBovIFN-γ基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，pVAX1-PreBovIFN-γ轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞可見強(qiáng)烈的綠色熒光 (圖 1A)，而空載體質(zhì)粒pVAX1轉(zhuǎn)染和處理后未見熒光 (圖1B)。

圖1 COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Immunoflurescence analysis of transfected COS-7 cells.(A) COS-7 cells transfected with recombinant plasmid pVAX1-PreBovIFN-γ. (B) COS-7 cells transfected with plasmid pVAX1.

2.2 重 組 菌 BL21(DE3)(pET-30a-BovIFN-γ)、BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ) 表達(dá)產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

取 重 組 菌 BL21(DE3)(pET-30a-BoIFN-γ) 、BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ) 未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的全菌裂解上清、純化蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE電泳 (圖 2、3)。電泳結(jié)果表明 BoIFN-γ基因在重組菌中獲得成功表達(dá)，分別于分子量為23、43 kDa處有一明顯的增量蛋白帶，與預(yù)期融合蛋白的分子量和純化產(chǎn)物大小一致，而未誘導(dǎo)菌在相應(yīng)分子量處未見此條帶。

2.3 間接免疫熒光檢測(cè)rBac-BoIFN-γ表達(dá)

以抗BoIFN-γ單抗5G4為一抗分別檢測(cè)野生型桿狀病毒感染 Sf9細(xì)胞、重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，結(jié)果顯示，感染重組桿狀病毒的sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯綠色熒光 (圖4A)，而感染野生型桿狀病毒的Sf9細(xì)胞未見熒光 (圖 4B)，可見 rBac-BoIFN-γ在桿狀病毒系統(tǒng)中得到成功表達(dá)。

圖2 rHis-BoIFN-γ的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of rHis-BoIFN-γ. M: protein marker; 1: supernatants of lysate of BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)without induced by IPTG; 2: supernatants of lysate of BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ) induced by IPTG; 3: purified rHis-BoIFN-γ protein.

圖3 rGST-BoIFN-γ的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of rGST-BoIFN-γ. M: protein marker;1: supernatants of lysate of BL21(pGEX-6P-1-BoIFN-γ) without induced by IPTG; 2: supernatants of lysate of BL21(pGEX-6P-1-BoIFN-γ) induced by IPTG; 3: purified rGST-BoIFN-γ protein.

圖4 間接免疫熒光檢測(cè) rBac-BoIFN-γ在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 4 IFA detecting expression of rBac-BoIFN-γ in Sf9 cells.(A) Sf9 cells transfected with recombinant plasmid Bacmid-BoIFN-γ. (B) Sf9 cells transfected with plasmid Bacmid.

2.4 重組BoIFN-γ抗病毒活性測(cè)定

利用VSV-MDBK細(xì)胞系統(tǒng)測(cè)定rBoIFN-γ抗病毒活性，大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的 rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ蛋白活性分別為 8.389×107U/mg和6.554×105U/mg，桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的細(xì)胞上清中rBac-BoIFN-γ活性為4.096×104U/mL。結(jié)果顯示，原核及真核系統(tǒng)表達(dá)的rBoIFN-γ均具有較高的抗病毒活性 (圖5)。

2.5 重組BoIFN-γ的雙單抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

2.5.1 ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

根據(jù)方陣實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定包被抗體5G4最佳使用濃度為10 μg/mL，檢測(cè)抗體Biotin-3E6最佳稀釋倍數(shù)為1∶2 000。

圖5 重組BoIFN-γ抗病毒活性測(cè)定結(jié)果Fig. 5 Antiviral activities analysis of recombinant BoIFN-γ. (A) MDBK cells with VSV. (B) MDBK cells with VSV and recombinant BoIFN-γ. (C) MDBK cells.

2.5.2 重組BoIFN-γ的定量分析

采用雙夾心ELISA的方法分別測(cè)定rHis-BoIFN-γ和 rBac-BoIFN-γ，通過倍比稀釋的方法，取抗病毒活性值的對(duì)數(shù)和 OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過對(duì)數(shù)回歸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 (圖6)。根據(jù)ELISA的OD值(Y值) 利用建立的方程計(jì)算重組BoIFN-γ樣品的抗病毒活性值。

圖6 雙單抗夾心ELISA檢測(cè)BoIFN-γ標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Fig. 6 Standard cruve of rBoIFN-γ detection by ELISA. (A)rHis-BoIFN-γ. (B) rBac-BoIFN-γ.

2.6 真核rBac-BoIFN-γ表達(dá)水平的優(yōu)化

由結(jié)果可見，不同病毒接種量對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響不大，但是對(duì)于蛋白表達(dá)高峰的出現(xiàn)時(shí)間有影響，隨著病毒接種量的降低，表達(dá)高峰出現(xiàn)時(shí)間逐漸往后推移 (圖 7)。由于細(xì)胞會(huì)逐漸裂解，為防止昆蟲細(xì)胞蛋白組分對(duì)蛋白產(chǎn)物的污染，以及蛋白產(chǎn)物發(fā)生降解，病毒接種量不應(yīng)太低，蛋白收獲時(shí)間不應(yīng)超過120 h。

圖7 不同接種量和時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響Fig. 7 Influence of vaccination quantity and time point on the production of rBac-BoIFN-γ.

3 討論

干擾素是一類多功能細(xì)胞因子，具有抵抗病毒感染、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。干擾素分為 I型和Ⅱ型兩類，I型干擾素包括IFN-α和 IFN-β，Ⅱ型干擾素 IFN-γ，又稱免疫干擾素。目前在國(guó)內(nèi)外奶牛養(yǎng)殖過程中，出現(xiàn)奶牛乳腺炎、口蹄疫、牛結(jié)核等多種疾病，嚴(yán)重影響奶牛的產(chǎn)奶產(chǎn)量和質(zhì)量，還給畜牧場(chǎng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。干擾素作為免疫應(yīng)答的自然誘導(dǎo)物和調(diào)節(jié)物，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景。

IFN-γ基因在正常情況下處于封閉狀態(tài)，必須在各種特異性或非特異性刺激因子的刺激下才能表達(dá)，因此要獲得高效價(jià)廉的IFN-γ，需通過基因工程技術(shù)大量制備和生產(chǎn)，使其在動(dòng)物中的應(yīng)用成為可能。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但是大腸桿菌表達(dá)的蛋白多以包涵體或部分可溶的形式存在，不能進(jìn)行翻譯后的修飾等過程，使其存在活性低、純化復(fù)性步驟繁瑣、內(nèi)毒素難以去除等諸多缺陷，因此在臨床應(yīng)用中受到一定程度的限制。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠較好地對(duì)重組蛋白糖基化和剪切折疊，比原核表達(dá)系統(tǒng)更優(yōu)越，表達(dá)產(chǎn)物比活性更高，更適合細(xì)胞因子的表達(dá)，而且桿狀病毒具有高度的種屬特異性，僅感染昆蟲，對(duì)脊椎動(dòng)物無感染性，其表達(dá)產(chǎn)物安全可靠，經(jīng)過簡(jiǎn)單處理即可以直接應(yīng)用于畜禽疾病的臨床治療。

本研究通過對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了重組BoIFN-γ在大腸桿菌系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)，及在桿狀病毒系統(tǒng)中的分泌性表達(dá)，經(jīng)抗病毒活性檢測(cè)顯示，3種重組蛋白 rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ和rBac-BoIFN-γ均具有較高生物學(xué)活性，為應(yīng)用于病毒和腫瘤性疾病的治療提供了材料，有望在牛感染性疾病的防治中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室通過建立的BoIFN-γ抗原捕獲ELISA法檢測(cè)奶牛臨床血漿樣品，并以商品化試劑盒作為平行對(duì)照，結(jié)果顯示 2種方法檢測(cè)符合率達(dá)到 83.9%[13]。同時(shí)，本研究還建立了BoIFN-γ的雙單抗夾心ELISA檢測(cè)方法，并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，可測(cè)定大腸桿菌和桿狀病毒表達(dá)的 BoIFN-γ，定量分析其抗病毒活性，該方法與MDBK/VSV系統(tǒng)所測(cè)定結(jié)果符合，且比后者更為安全、便捷、準(zhǔn)確，為 BoIFN-γ的生物學(xué)功能、作用機(jī)理的研究及臨床應(yīng)用提供了一種有效的手段。

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Expression and antiviral assay of bovine interferon-γ

Zhengzhong Xu*, Xiang Chen*, Fengli Shan, Chuang Meng, Lin Sun, Jinlin Huang, Zhiming Pan,Shizhong Geng, and Xin’an Jiao
Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China

Received: July 5, 2010; Accepted: September 21, 2010

Supported by: Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 06104396).

Corresponding author: Jie Wang. Tel: +86-20-36654245; E-mail: jiew@tom. com

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (No. 06104396) 資助。