王凡，王小娟，寧蔚文，劉中華

湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 蛋白質(zhì)組學(xué)和發(fā)育生物學(xué)國家教育部重點實驗室，長沙 410081

虎紋捕鳥蛛毒素XI (HWTX-XI) 突變體的真核表達(dá)及活性鑒定

王凡，王小娟，寧蔚文，劉中華

湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 蛋白質(zhì)組學(xué)和發(fā)育生物學(xué)國家教育部重點實驗室，長沙 410081

虎紋捕鳥蛛毒素-XI (HWTX-XI) 是從虎紋捕鳥蛛粗毒中分離的含55個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，兼有胰蛋白酶抑制活性和電壓門控鉀離子通道抑制活性。通過突變 HWTX-XI上的鉀離子通道抑制活性關(guān)鍵氨基酸殘基設(shè)計了 2個突變體 (分別突變以下氨基酸殘基：R5I,R10T,R25A和R5I,R25A)，利用pVT102U/α表達(dá)載體在釀酒酵母S78中成功表達(dá)并獲得了高純度的重組蛋白質(zhì)；通過分光光度計比色法、膜片鉗技術(shù)和小鼠腦室注射分別比較三者的胰蛋白酶和鉀通道抑制活性以及動物毒性，結(jié)果顯示：HWTX-XI突變體與HWTX-XI有相同胰蛋白酶抑制活性，但其鉀通道活性降低約30倍；小鼠腦室注射HWTX-XI的半致死劑量為247.3 μg/kg體重，而突變體在劑量達(dá)到25 mg/kg時仍未見明顯毒性反應(yīng)。獲得了胰蛋白酶抑制活性保留，但鉀通道抑制活性和動物毒性大大降低的突變體，為 HWTX-XI胰蛋白酶抑制活性的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

虎紋捕鳥蛛毒素XI，真核表達(dá)，突變體，胰蛋白酶抑制活性，鉀離子通道抑制活性

Abstract:Huwentoxin-XI (HWTX-XI) is a protein isolated from the crude venom of spider Ornithoctonus huwena. It has 55 amino acid residues containing 6 cysteine residues forming 3 disulfide bonds. It shows potent inhibitory effect on trypsin and voltage-gated potassium channels in rat dorsal root ganglion cells. According to the structure-function relationship of HWTX-XI, we designed two mutants through mutation of potassium channel inhibition related amino acid residues (R5I,R10T,R25A and R5I,R25A)and then expressed them with high purity by using the vector pVT102U on Saccharamyces cerevisiae strain S78; The two mutants had the same trypsin inhibition activity as HWTX-XI, whereas their potassium channel inhibition activity and animal toxicity were much lower than those of HWTX-XI. This study is helpful for designing drugs of trypsin related diseases based on HWTX-XI.

Keywords:HWTX-XI, mutant, eukaryotic expression, trypsin inhibition activity, potassium channel inhibition activity

虎紋捕鳥蛛毒素 XI(HWTX-XI) 是從蜘蛛毒素中新發(fā)現(xiàn)的一種毒素，由55個氨基酸殘基組成，含3對二硫鍵，屬于BPTI/Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族；HWTX-XI的胰蛋白酶抑制活性強(qiáng)于牛胰蛋白酶抑制劑BPTI，是目前世界上發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的多肽類胰蛋白酶抑制劑，初步藥理學(xué)實驗表明HWTX-XI在動物急性胰腺炎模型上具有較好的療效[1]。然而，HWTX-XI對于電壓門控鉀通道具有一定抑制活性，在整體動物水平表現(xiàn)出較弱的神經(jīng)毒性。因此通過引入氨基酸突變[2]，降低HWTX-XI的鉀離子通道活性，將減弱其毒副作用，進(jìn)一步提升利用HWTX-XI進(jìn)行藥物研發(fā)的應(yīng)用前景。

根據(jù)前期結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究可知：與HWTX-XI兩種生物學(xué)活性相關(guān)的功能位點在其分子表面具有相對獨立性。其中 Lys14是 HWTX-XI胰蛋白酶在抑制活性的關(guān)鍵殘基，Lys14突變?yōu)锳la使多肽分子的酶抑制活性喪失，但其鉀離子通道抑制活性未受影響；與 Lys14靠近的氨基酸殘基對于其胰蛋白酶活性具有一定作用，但影響不大，其中Arg10突變?yōu)楹u基氨基酸殘基Thr可使HWTX-XI的胰蛋白酶抑制活性少許上升。HWTX-XI的離子通道活性位點在N-端螺旋和在空間上與之鄰近的β-轉(zhuǎn)角2個區(qū)域，其中第5位Arg突變?yōu)镮le以及第25位Arg突變?yōu)锳la均導(dǎo)致鉀離子通道活性降低。根據(jù)以上結(jié)論設(shè)計HWTX-XI的2個突變體 (mut1和mut2)，野生型HWTX-XI和2個突變體的氨基酸序列如圖1所示。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

釀酒酵母菌 S78 (Saccharomyces cerevisiae Strain S78)、酵母穿梭質(zhì)粒 pVT102U/α[4-5]和大腸桿菌TOP10均為本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

YSD培養(yǎng)基：Yeast Nitrogen Base 6.7 g/L，葡萄糖20 g/L，亮氨酸200 mg/L，腺嘌呤100 mg/L，肌醇200 mg/L，112 ℃滅菌20 min；YSD固體培養(yǎng)基：100 mL YSD培養(yǎng)液加瓊脂粉1.5 g；YPD培養(yǎng)基：酵母浸出物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，112 ℃滅菌20 min；YPD固體培養(yǎng)基：100 mL YPD培養(yǎng)液加瓊脂粉1.5 g。

1.1.3 試劑和儀器

Taq酶購自MBI Fermentas公司。蛋白胨購自上海生工生物工程有限公司。酵母浸出物購自O(shè)xoid公司。α-氰基-4-羥基肉桂酸 (α-cyano-4-hydoxycinnamic acid，CCA)、三氟乙酸 (TFA)、胰蛋白酶 (Trypsin)均為 Sigma產(chǎn)品。其他為國產(chǎn)分析純試劑。ProFLEXTMⅢ型 MALDI-TOF(Matrix-assisted Laser desorption/ionization-time-of-flight)質(zhì)譜儀購自Bruker公司。Waters650E型HPLC系統(tǒng) (486UV檢測器，millennium色譜工作站)。Waters HPLC workstation (515pump，2487UV檢測器)。PCR儀購自Bio-RAD公司。

圖1 HWTX-XI及其突變體的氨基酸序列 (HWTX-XI中紅色標(biāo)記的氨基酸殘基分別突變?yōu)閮蓚€突變體mut1和mut2中相應(yīng)的氨基酸殘基紅色標(biāo)記)Fig. 1 Amino acid sequence of HWTX-XI and its mutants. The residues labeled with red in two mutants (mut1 and mut2) are the mutated residues.

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計

PCR引物根據(jù)pVT102U/α-HWTX-XI-R25A序列設(shè)計并由金斯特公司合成，采用反向 PCR從pVT102U/α-HWTX-XI-R25A 質(zhì)粒擴(kuò)增目的片段 (大小約200 bp)，引物中設(shè)計引入突變位點。引物序列如表1所示。

表1 HWTX-XI突變體的引物序列Table 1 Primer sequence of HWTX-XI mutants

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增出來的突變體基因采用Promega的PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，然后用XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切16 h，再使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸定量。與此同時，pVT102U載體也采用XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切16 h，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒回收。取2 μL載體片段和6 μL酶切后的PCR片段在12 μL體系中進(jìn)行連接，16 ℃過夜，次日轉(zhuǎn)化 TOP10感受態(tài)細(xì)胞，然后采用XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切篩選陽性克隆。測序正確的載體命名為 pVT-HWTX-XI-mut1和pVT-HWTX-XI-mut2。

1.2.3 基因轉(zhuǎn)化

酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備：S78 YPD平板于30 ℃培養(yǎng)2~3 d，挑單克隆于3 mL YPD溶液中，30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。取2個1.5 mL離心管 (滅菌)，各放1 mL菌液，4 000 r/min離心5 min。細(xì)胞懸于1 mL滅菌ddH2O中，4 000 r/min離心5 min。倒去上清，細(xì)胞懸浮于 1 mL混合溶液中 (10× TE，1 mol/L LiAc，ddH2O，以 1∶1∶8的體積比混合)。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：將表達(dá)載體質(zhì)粒pVT-HWTX-Ⅺ-mut1 (mut2)1.0 μg；Carrier DNA 10 μg；上述菌懸液 20 μL；PEG溶液 (10× TE，1 mol/L LiAc，50% PEG4000，以1∶1∶8的體積比混合) 1 mL加入1.5 mL無菌管中，混合，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)30 min。42 ℃熱擊15 min后，5 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用 200 μL 1× TE 洗滌，5 000 r/min離心 5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀懸浮于200 μL 1× TE溶液中，細(xì)胞懸浮液涂YSD板，30 ℃培養(yǎng)4~6 d。

1.2.4 蛋白質(zhì)的表達(dá)

挑取YSD板上直徑為0.5~1 mm菌斑于25 mL YSD溶液中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，然后以1∶30的比例轉(zhuǎn)入750 mL YPD溶液中，30 ℃、250 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)3~4 d。

1.2.5 蛋白質(zhì)的純化與鑒定

將培養(yǎng)的菌液在4 ℃、11 000 r/min條件下離心20 min，取上清，然后用抽濾瓶抽濾，得到樣品。用2個柱體積的平衡液 (0.1 mol/L NaAc pH 4.2) 平衡CM-Sepharose陽離子交換柱，將表達(dá)上清上樣，上樣完畢后用 10個柱體積的平衡液沖洗，去除色素。采用分步洗脫的方法，依次用含 0.1、0.2、0.5、1 mol/L NaCl的 0.1 mol/L NaAc (pH 4.2) 緩沖液進(jìn)行洗脫。收集每個洗脫峰，把含有目的蛋白質(zhì)的洗脫峰進(jìn)一步脫鹽反相純化。取 5 μL洗脫峰溶液和5 μL飽和的CCA溶液混合，然后取1 μL點樣，待樣品自然干燥后上STR MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定[3]。

1.2.6 分光光度計法檢測HWTX-XI突變體的胰蛋白酶抑制活性

HWTX-XI及其突變體溶于雙蒸水中，胰蛋白酶溶于0.001 mol/L的鹽酸，底物BAPNA先在80 ℃的雙蒸水中溶解，然后快速冷卻至室溫，防止BAPNA的再結(jié)晶。準(zhǔn)確定量的胰蛋白酶抑制活性測定采用傳統(tǒng)的分光光度計的方法進(jìn)行[4]。反應(yīng)的緩沖液為 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.1)，20 mmol/L CaCl2，0.05% triton X-100，反應(yīng)時取100 μL反應(yīng)緩沖液和不同體積的 HWTX-XI突變體 (1×10?5mol/L) 相混合，然后加入10 μL胰蛋白酶，并用緩沖液補(bǔ)齊抑制劑體積的差異，再次混勻后，室溫靜置15 min，使之相互作用，然后加入30 μL底物 (1.2 mmol/L)，殘余的胰蛋白酶即和底物反應(yīng)，反應(yīng)5 min后加入10 μL 60%乙酸終止反應(yīng)，然后在405 nm的波長下檢測吸收值，可用于計算抑制劑的動力學(xué)常數(shù)[4]。

1.2.7 膜片鉗電生理活性鑒定

全細(xì)胞膜片鉗實驗采用急性分離和短期培養(yǎng)的大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行[5]。玻璃電極經(jīng)兩步拉制后熱拋光，所得電極尖端口徑為 1.5~2.0 μm，充電極內(nèi)液后入水電阻為2~4 M?[6]。用于鉀電流記錄的細(xì)胞外液為：130 mmol/L 氯化膽堿，5 mmol/L KOH，12 mmol/L D型葡萄糖，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，pH為 7.40。電極內(nèi)液為：120 mmol/L 氟化鉀，20 mmol/L NMG，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgATP，0.5 mmol/L Li2GTP，pH為7.4。實驗細(xì)胞形成全細(xì)胞記錄模式后穩(wěn)定 4~6 min。記錄電流經(jīng)PEC-10放大器 (HEKA，German) 10 KHz濾波過濾。數(shù)據(jù)和圖形用pulsefit+pulse 8.0軟件采集分析[7]。

1.2.8 小鼠腦室注射

腦室注射 (Intracerbroventricular，icv) 給藥用去頭皮法[8]。昆明種小鼠雌雄各半，體重18~22 g，分為6組，每組8只；野生型HWTX-XI及其突變體以生理鹽水 15 μL溶解，分別以 562.5、375、250、165、110 μg/kg的劑量注射；注射前對小鼠實施乙醚麻醉，以兩耳連線的中點為中心剪去皮膚約5 mm×5 mm，實驗時在矢狀縫和人字縫交點一側(cè)1~2 mm間用微量注射器注入藥液15 μL，注射完后立即觀察動物反應(yīng)，觀察 48 h；統(tǒng)計小鼠死亡比例，并按改良寇氏法公式計算野生型HWTX-XI的LD50值。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白質(zhì)在釀酒酵母中的表達(dá)及分離純化

HWTX-XI兩個突變體基因均以 PCR的方法獲得，大小約190 bp，克隆至表達(dá)質(zhì)粒pVT102U，經(jīng)過陽性克隆篩選、測序獲得了突變成功的 2個突變體重組表達(dá)質(zhì)粒：pVT-HWTX-XI-mut1和pVT-HWTX-XI-mut2；并利用釀酒酵母 S78菌株表達(dá) 2個突變體及其 HWTX-XI。該表達(dá)系統(tǒng)屬于組成型表達(dá)，表達(dá)的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中，這對于目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化有利[9-11]。利用該表達(dá)系統(tǒng)，本實驗室成功地表達(dá)了多個蜘蛛多肽毒素，并且證明結(jié)合陽離子交換 (CM-Sepharose) 和反相-HPLC分離，可獲得高純度目標(biāo)產(chǎn)物[12]。圖2為HWTX-XI及其2個突變體經(jīng)過離子交換分離后進(jìn)一步采用反相-HPLC分離的色譜圖，野生型HWTX-XI反相-HPLC洗脫的乙腈濃度與天然 HWTX-XI相似，而2個突變體的乙腈洗脫濃度分別高于野生型，這與2個突變體分別將極性氨基酸殘基Arg突變?yōu)榉菢O性氨基酸Ile相符。質(zhì)譜分析顯示野生型反相-HPLC色譜圖主峰的分子量與天然 HWTX-XI相同，Edman降解測定 N-端序列也完全相同；2個突變體的質(zhì)譜測定分子量也與理論分子量相同 (圖 2)。以上結(jié)果表明通過釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了重組 HWTXXI及其2個突變體 (HWTX-XI-mut1和HWTX-XI-mut2)，且獲得了純度較高的目的產(chǎn)物。

2.2 HWTX-XI及其突變體的胰蛋白酶抑制活性比較

利用分光光度計比色方法，測定了 HWTX-XI及其突變體對胰蛋白酶的的抑制作用，并用雙倒數(shù)法得到了它們與胰蛋白酶抑制的平衡常數(shù)。如表 2所示，野生型 HWTX-XI對胰蛋白酶的抑制常數(shù)為8.9×10?8mol/L，HWTX-XI-mut1 和 HWTX-XI-mut2對胰蛋白酶的抑制常數(shù)與野生型的在同一數(shù)量級。該結(jié)果與預(yù)期相符，因為 2個突變體的突變位點不是HWTX-XI作為胰蛋白酶抑制劑的關(guān)鍵活性殘基，因此其胰蛋白酶抑制活性未受到影響。

表2 野生型HWTX-XI及其突變體與胰蛋白酶作用的抑制常數(shù)Table 2 The bind parameters of HWTX-XI and its mutants to trypsin

2.3 HWTX-XI及其突變體鉀通道抑制活性比較

通過膜片鉗檢測表明，HWTX-XI及其突變體對大鼠DRG細(xì)胞上鉀通道電流均有部分抑制作用 (圖3)。野生型HWTX-XI在10 μmol/L時可抑制60%鉀通道電流，根據(jù)其濃效曲線推測IC50值為3.92 μmol/L(圖 3A)；HWTX-XI-mut1和 HWTX-XI-mut2 在10 μmol/L時抑制約 30%鉀通道電流，繼續(xù)增加濃度至100 μmol/L，抑制率仍低于50%，推測2個突變體的 IC50值超過 100 μmol/L (圖 3B、3C)。該結(jié)果說明通過突變 HWTX-XI鉀通道抑制活性關(guān)鍵氨基酸殘基，從而獲得了鉀通道抑制活性大大降低的突變體，其鉀通道抑制活性約降低30倍。

2.4 HWTX-XI及其突變體小鼠腦室注射毒性比較

利用小鼠腦室注射，進(jìn)一步評價了HWTX-XI及其突變體的動物毒性。昆明種小鼠腦室注射HWTX-XI后，1 min內(nèi)表現(xiàn)出極度興奮、劇烈奔跑、翻滾等現(xiàn)象，嚴(yán)重的全身抽搐，最后衰竭而死，癥狀較輕微的也需48 h才能恢復(fù)。求出HWTX-XI小鼠腦室注射的半數(shù)致死劑量LD50值為247.34 μg/kg；而小鼠腦室注射2個HWTX-XI突變體在劑量達(dá)到25 mg/kg時未見明顯毒性反應(yīng)，可見氨基酸突變大大降低了動物毒性，該實驗結(jié)果與膜片鉗實驗結(jié)果相吻合。

圖3 HWTX-XI及其突變體對大鼠DRG細(xì)胞電壓敏感鉀通道電流的抑制作用Fig. 3 Inhibition of HWTX-XI and its mutants on voltage-gated potassium channels on rat DRG cells (A?C) and the concentration-response relationship (D).

本研究在前期結(jié)構(gòu)與功能研究基礎(chǔ)上，通過突變 HWTX-XI鉀通道抑制活性的關(guān)鍵氨基酸殘基，設(shè)計了2個突變體，并利用pVT102U表達(dá)載體和釀酒酵母 S78菌株成功表達(dá)了 HWTX-XI-mut1和HWTX-XI-mut2兩個突變體。胰蛋白酶抑制活性、鉀通道抑制活性和動物毒性比較表明2個突變體具有與 HWTX-XI相同強(qiáng)度的胰蛋白酶抑制活性，而其鉀通道抑制活性大大降低，從而大大減弱了動物毒性。本研究進(jìn)一步證明了 HWTX-XI分子雙功能位點的相對獨立性，并為 HWTX-XI胰蛋白酶抑制活性的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[13-14]。

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Expression and characterization of Huwentoxin-XI (HWTX-XI) and its mutants

Fan Wang, Xiaojuan Wang, Weiwen Ning, and Zhonghua Liu
Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology, Ministry of Education, Hunan Normal University, Changsha 410081, China

Received: June 22, 2010; Accepted: August 10, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30530500), National Basic Research Program of China (973 Proaram) (No.2006CB101906).

Corresponding author: Rongxiang Fang. Tel/Fax: +86-10-64858245; E-mail: fangrx@im.ac.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 30530500)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2006CB101906) 資助。