王麗，王捷，楊德猛，楊傳紅，夏冰，王江濤，冼江

1 華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006

2 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，廣州 510010

骨唾液酸蛋白基因沉默抑制乳腺癌細(xì)胞與骨基質(zhì)粘附

王麗1,2，王捷2，楊德猛1,2，楊傳紅2，夏冰2，王江濤2，冼江2

1 華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006

2 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，廣州 510010

旨在探索骨唾液酸蛋白 (Bone sialoprotein，BSP) 基因沉默對(duì)親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞 (MDA-MB-231BO) 與骨基質(zhì)粘附能力的影響，為以BSP為靶點(diǎn)的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移預(yù)防和靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。體外檢測(cè)BSP基因沉默對(duì)乳腺癌細(xì)胞與小鼠骨基質(zhì)粘附能力的影響，MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；掃描電鏡觀察骨片表面腫瘤細(xì)胞粘附情況和骨吸收狀況；ELISA法檢測(cè)骨基質(zhì)細(xì)胞粘附培養(yǎng)上清中TGF-β1和RANKL表達(dá)分泌量差異；左心室注射法構(gòu)建裸鼠骨轉(zhuǎn)移模型，檢測(cè)不同細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果提示BSP基因沉默可抑制親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞與骨基質(zhì)粘附能力和增殖能力。親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞易與骨基質(zhì)發(fā)生粘附，粘附部位可見骨吸收造成的骨基質(zhì)破壞。BSP基因沉默引起部分細(xì)胞表面形態(tài)的改變，并對(duì)TGF-β1和RANKL的表達(dá)和分泌具有抑制作用。裸鼠骨組織X線檢查和HE染色結(jié)果顯示，沉默BSP基因可在一定程度上抑制骨轉(zhuǎn)移發(fā)生和轉(zhuǎn)移灶發(fā)展。結(jié)果證實(shí)BSP基因沉默可抑制親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞增殖、骨基質(zhì)粘附，影響細(xì)胞表面形態(tài)，進(jìn)而抑制骨轉(zhuǎn)移。

骨唾液酸蛋白，基因沉默，乳腺癌，骨轉(zhuǎn)移，骨基質(zhì)粘附

Abstract:We performed this research mainly to explore the effect of bone sialoprotein (BSP) silence by siRNA on the adhesion ability to bone matrix of bone-seeking breast cancer cells (MDA-MB-231BO). Also we aimed to provide experimental data for prevention and treatment of breast cancer bone metastasis by targeting BSP. We explored the effects of BSP gene silence on characteristics of bone-seeking breast cancer cells: proliferation by MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt] assay, bone adhesion ability by a mouse bone adhesion model in vitro, morphology of the cells by SEM, and secretion of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and receptor activator ofnuclear factor-kappa B ligand (RANKL) by ELISA kits. We performed intra-cardiac injection in nude mice to explore bone metastatic ability of different cell lines. The results showed that knockdown of BSP significantly inhibited the proliferation of MDA-MB-231BO cells and their adhesion to bone matrix. We also observed bone destruction caused by bone resorption around some adhering cells. The appearances of the cells changed in BSP gene silenced group, and the secretion of TGF-β1and RANKL decreased. The results showed BSP gene silence can partial inhibition bone metastasis of breast cancer cells in nude mice by X-ray assay and hematoxylin-eosin staining. Based on our research, siRNA-mediated BSP silencing can inhibit proliferation and adhesion to bone matrix of bone-seeking breast cancer cells and change their surface structure, thus inhibits their bone metastatic ability.

Keywords:bone sialoprotein, gene silencing, breast cancer, bone metastasis, bone matrix adhesion

骨唾液酸蛋白 (Bone sialoprotein，BSP) 是一種高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白，富含唾液酸，平均分子量約 75 kDa，屬于 SIBLINGs (Small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins) 家族成員。BSP主要分布在礦質(zhì)化的組織中，由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞表達(dá)和分泌。1994年Bellahcence等首次闡述了BSP在易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的人乳腺癌中表達(dá)[1]。多項(xiàng)研究提示BSP在腫瘤的粘附、增殖、侵襲、基質(zhì)降解、免疫反應(yīng) (炎癥和補(bǔ)體逃逸)、血管生成等轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個(gè)過程中發(fā)揮重要作用。BSP cDNA全片段轉(zhuǎn)染的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231-BAG可使裸鼠體內(nèi)的乳腺癌轉(zhuǎn)移灶明顯增大[2]。在高表達(dá) BSP的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，乳腺癌導(dǎo)致的骨和全身性轉(zhuǎn)移灶明顯增加[3]。而下調(diào)BSP可以抑制乳腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移，減少溶骨性骨損傷面積[4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β) 是影響骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程的重要細(xì)胞因子之一，在破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收時(shí)儲(chǔ)存在骨中的TGF-β從骨中釋放，刺激乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生破骨細(xì)胞的強(qiáng)力趨化因子——甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白，活化破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收[5]。腫瘤細(xì)胞與骨基質(zhì)粘附是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，我們前期研究發(fā)現(xiàn) BSP單克隆抗體對(duì)MDA-MB-231BO和骨基質(zhì)黏附具有特異抑制作用[5]，并通過RNAi技術(shù)獲得BSP基因抑制表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞231BO-BSP27[6]。該細(xì)胞株BSP基因在mRNA水平和蛋白水平抑制效率分別為 70.8%和69.3%[6]，一段時(shí)間后 (超過20代) 再檢測(cè)BSP蛋白表達(dá)抑制率為 69.3%[7]，由此認(rèn)為沉默效果基本穩(wěn)定。本研究擬檢測(cè)BSP基因沉默對(duì)231BO-BSP27與骨基質(zhì)粘附能力的影響，并通過掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞表面形態(tài)及其在骨片表面的粘附情況。為深入研究 BSP在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制，以及 BSP為靶點(diǎn)的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

昆明種雌性小鼠[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)(KM)060931](20±2)g，BALB/C-nu/nu 雌性裸鼠[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：0058418] (14~16) g，SPF級(jí)，由廣東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系 (MDA-MB-231BO，簡(jiǎn)稱231BO) 由美國(guó)德州大學(xué)圣安東尼健康科學(xué)中心 Yoneda教授惠贈(zèng)。經(jīng)siRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染穩(wěn)定沉默 BSP基因表達(dá)的親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系 (MDA-MB-231BO-BSP27，簡(jiǎn)稱 231BO-BSP27) 和轉(zhuǎn)染無關(guān)質(zhì)粒的陰性對(duì)照親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系 (MDA-MB-231BO-Scrambled，簡(jiǎn)稱 231BO-Scrambled) 由本實(shí)驗(yàn)室制備[6]。小鼠TGF-β1 ELISA試劑盒購自博士德公司。小鼠RANKL ELISA試劑盒購自R&D公司。Ⅰ型膠原酶(201 U/mg) 購自 Gibco公司。胰蛋白酶購自Invitrogen公司。MTS購自 Promega公司。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液購自Hyclone公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

231BO、231BO-BSP27、231BO-Scrambled乳腺癌細(xì)胞在含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液、5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3 BSP基因沉默對(duì)親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞與骨基質(zhì)粘附能力的影響

在24孔組織培養(yǎng)板中，將膠原酶和胰蛋白酶溶液處理的小鼠頂骨 (Parietal bones) 骨片固定于1%瓊脂表面[5,8]，各孔分別加入1 mL濃度為105個(gè)/mL的231BO、231BO-BSP27和231BO-scrambled細(xì)胞，對(duì)照組無腫瘤細(xì)胞。37 ℃、5% CO2孵育48 h。鏡下觀察骨片粘附情況。收集粘附到骨片上的細(xì)胞，經(jīng)過甲苯胺藍(lán)染色，測(cè)定OD488。以O(shè)D488值變化間接計(jì)算 3株腫瘤細(xì)胞與骨片粘附的相對(duì)數(shù)量差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，總計(jì)16組。粘附抑制率%= (1?沉默組 OD488/親代組 OD488) ×100%。

為驗(yàn)證粘附差異是否由 3株細(xì)胞增殖速度不同造成，在無骨片的條件下按上述方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分別于24、48、72 h吸取細(xì)胞懸液100 μL轉(zhuǎn)移到96孔板，并通過MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖。其中24孔板做3個(gè)重復(fù)，96孔板做6個(gè)重復(fù)。增殖抑制率%=(1?沉默組 OD/親代組 OD)×100%，其中 OD=OD490?OD620。

1.4 掃描電鏡觀察腫瘤細(xì)胞粘附狀況

按1.3的方法將腫瘤細(xì)胞和骨片共培養(yǎng)72 h。經(jīng)3%戊二醛 (pH 7.0) 固定后，梯度脫水、冷凍干燥、濺射，掃描電鏡觀察骨片表面細(xì)胞形態(tài)及粘附狀況。以相同條件培養(yǎng)72 h但無腫瘤細(xì)胞的空白骨片作對(duì)照。

1.5 ELISA 檢測(cè)沉默 BSP 對(duì) TGF-β1、RANKL表達(dá)的影響

用小鼠 RANKL ELISA檢測(cè)試劑盒和小鼠TGF-β1ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上述48 h培養(yǎng)上清的RANKL和TGF-β1含量，以無腫瘤細(xì)胞的空白骨片和不添加骨片的細(xì)胞培養(yǎng)上清作對(duì)照。在450 nm檢測(cè)紫外吸收，以620 nm為參考波長(zhǎng)。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.6 BSP基因沉默對(duì)乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移能力的影響

將21只4~6周齡的雌性裸鼠隨機(jī)分為3組，每組7只，分別于左心室注射0.1 mL濃度為2.5×106個(gè)/mL的231BO、231BO-BSP27和231BO-scrambled細(xì)胞。第4周X射線檢查骨損傷程度。處死后取四肢骨組織，經(jīng)固定、脫鈣、石蠟包埋、冷凍切片，HE染色觀察組織切片轉(zhuǎn)移灶的有無、數(shù)量和大小。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 BSP基因沉默抑制乳腺癌細(xì)胞與骨基質(zhì)粘附

將3種乳腺癌細(xì)胞分別與骨片共培養(yǎng)48 h，顯微鏡下可見 3種細(xì)胞在骨片表面結(jié)團(tuán)生長(zhǎng)，而空白對(duì)照組沒有。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示231BO-BSP27在488 nm處的吸光值明顯小于其他2組 (表1)。以上數(shù)據(jù)表明穩(wěn)定沉默BSP基因可以抑制親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞與骨基質(zhì)的粘附，抑制率為48.53% (P＜0.01)，231BO-Scrambled組與 231BO組無顯著差異 (P＞0.05)。而且，BSP基因沉默對(duì)細(xì)胞粘附的抑制率明顯大于其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，即沉默BSP可以抑制乳腺癌細(xì)胞與骨基質(zhì)粘附能力。

表1 BSP基因沉默抑制231BO細(xì)胞與骨基質(zhì)粘附 (n=16)Table 1 BSP silence inhibited the adhesion of 231BO cells to bone matrix (n=16)

MTS檢測(cè) 3種乳腺癌細(xì)胞 231BO、231BOBSP27、231BO-Scrambled在瓊脂表面的增殖能力，結(jié)果顯示 BSP基因沉默對(duì)親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞增殖具有抑制作用 (圖1)。0 h各組細(xì)胞數(shù)量無明顯差異，在24 h、48 h和72 h的抑制率分別為17.40%、19.55%和 19.54% (P＜0.01)，231BO-Scrambled組與231BO組無顯著差異 (P＞0.05)。

圖1 BSP基因沉默對(duì)231BO細(xì)胞增殖的影響 (n=6)Fig. 1 BSP silence inhibited the proliferation of 231BO cells(n=6).

2.2 掃描電鏡觀察骨片表面細(xì)胞粘附和骨損傷狀況

掃描電鏡觀察可見，接種乳腺癌的骨片表面粘附大量細(xì)胞，而對(duì)照組沒有 (圖2A~2D)。粘附在骨片表面的 231BO-BSP27沒有其他 2株細(xì)胞排列密集，這一結(jié)論與前面檢測(cè)到的3株細(xì)胞的粘附差異相吻合，但因細(xì)胞分散不十分均勻，因此不能作為定量指標(biāo)。部分細(xì)胞緊密粘附在骨片表面，并伸展成梭形 (圖 2E左側(cè)細(xì)胞)；部分細(xì)胞在發(fā)生粘附時(shí)出現(xiàn)結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，低倍鏡下呈現(xiàn)花樣外觀 (圖2A~2C)，高倍鏡下可見底層細(xì)胞與骨表面緊密粘附；部分細(xì)胞連接緊密，胞間分界不清晰 (圖2E)。乳腺癌細(xì)胞表面密布小突起和泡狀結(jié)構(gòu)，通過表面伸出的絲狀結(jié)構(gòu)緊密粘附于骨表面，并可見粘附細(xì)胞周圍明顯的骨質(zhì)破壞 (圖2F)。高倍鏡觀察發(fā)現(xiàn)231BO-BSP27細(xì)胞中存在異常的細(xì)胞表面形態(tài) (圖 2G)——細(xì)胞表面相對(duì)光滑，泡狀結(jié)構(gòu)明顯減少，表面凸起皺縮呈絨毛狀，細(xì)胞表面出現(xiàn)小孔 (圖 2G箭頭所示)。而 231BO和 231BO-Scrambled則未見此狀(圖 2F~2H)。由此可見BSP基因沉默可能導(dǎo)致細(xì)胞表面形態(tài)的改變，進(jìn)而影響細(xì)胞粘附能力和親骨轉(zhuǎn)移能力。

2.3 BSP基因沉默抑制骨基質(zhì)分泌 TGF-β1和RANKL

TGF-β1和RANKL的ELISA檢測(cè)結(jié)果 (圖3) 顯示，沉默BSP基因可以下調(diào)乳腺癌細(xì)胞與骨基質(zhì)粘附過程中 TGF-β1和 RANKL的表達(dá)和分泌。其對(duì)TGF-β1的影響較大，與親代231BO相比抑制率可達(dá)51.92% (P＜0.01)，對(duì)RANKL也有一定影響，抑制率為 21.15% (P＜0.01)。而 TGF-β1和 RANKL 在另2個(gè)骨片細(xì)胞共培養(yǎng)組的表達(dá)量沒有顯著差異，細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)各組差異也不顯著。但細(xì)胞和骨片共培養(yǎng)組表達(dá)量并不等于相應(yīng)兩者單獨(dú)培養(yǎng)表達(dá)量之和，這一現(xiàn)象可能與培養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)條件等多種因素相關(guān)。

圖2 SEM觀察粘附細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)Fig. 2 Surface ultrastructural characteristics of adhering cells as depicted under the SEM. (A) 231BO. (B) 231BO-BSP27. (C)231BO-Scrambled. (D) blank bone matrix. (E) 231BO-Scrambled. (F) 231BO. (G) 231BO-BSP27. (H) 231BO-Scrambled.

圖3 BSP基因沉默降低細(xì)胞與骨片共培養(yǎng)上清中TGF-β1(A) 和RANKL (B) 水平Fig. 3 BSP silence decreased the level of TGF-β (A) and RANKL (B) in cell-bone coculture supernatant, detected by the ELISA assay.

2.4 BSP基因沉默抑制乳腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移發(fā)生

左心室注射模型是研究腫瘤細(xì)胞體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移能力的經(jīng)典方法。但心內(nèi)注射容易引起小鼠死亡，建模難度較大。本研究中231BO組和231BO-scrambled組分別有2只裸鼠在心內(nèi)注射2 h內(nèi)死亡，因此未納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) (表2)。

表2 乳腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)移率Table 2 Rates of breast cancer bone metastasis in nude mice

本研究X線照片檢查異常表現(xiàn)包括 (圖4)：骨皮質(zhì)欠連續(xù)或缺損、骨膜反應(yīng)、周圍軟組織腫脹、蟲蝕樣骨質(zhì)破壞或大片骨質(zhì)破壞、甚至病理性骨折。綜合3組裸鼠X光拍攝結(jié)果來看，231BO-BSP27組裸鼠比其他2組裸鼠骨損傷數(shù)目少，損傷度低。

正常的骨組織經(jīng)HE染色后可見完整的骨髓腔，腔內(nèi)分散體積較小且均一的藍(lán)色骨髓細(xì)胞，以及一些分散的紅色血細(xì)胞。出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的病理性骨組織中，腫瘤細(xì)胞比正常的骨髓細(xì)胞核漿比大，部分骨皮質(zhì)因腫瘤細(xì)胞侵襲受到不同程度的損傷，許多腫瘤細(xì)胞聚集形成大小不規(guī)則的癌巢 (圖5)。

圖4 裸鼠骨損傷X光照片F(xiàn)ig. 4 X-ray scans of bone lesion of nude mice. (A) Healthy bone tissue. (B?D) Bone tissues with bone lesion.

圖5 骨組織HE染色結(jié)果Fig. 5 Results of HE stain of bone tissue. (A) Healthy bone tissue. (B?D) Bone tissues with breast cancer metastasis.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)BSP與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。多項(xiàng)研究證實(shí)，下調(diào)BSP可以抑制乳腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移，減少動(dòng)物模型中的溶骨性骨損傷面積。目前報(bào)道的降低BSP水平的方法有：反義核酸技術(shù)、BSP抗體抑制法、阻斷BSP的轉(zhuǎn)錄途徑——如通過氯丙嗪[9]、αvβ3[10]或 TGF-β 抗體[11]阻斷 BSP 表達(dá)，通過脂多糖(LPS)[12]或腫瘤壞死因子-α (TNF-α)[13]阻斷/促進(jìn)蛋白激酶A和酪氨酸激酶依賴的途徑抑制BSP基因轉(zhuǎn)錄，或利用siRNA和shRNA技術(shù)沉默BSP[6]等。上述方法都能夠不同程度地降低細(xì)胞內(nèi)BSP水平，然而，反義核酸技術(shù)雖然可以達(dá)到較高的沉默效率，僅僅是對(duì)BSP的瞬時(shí)沉默；雞源和鼠源抗體在人體內(nèi)的免疫原性、體內(nèi)運(yùn)輸性差、毒副作用限制了BSP抗體藥物的發(fā)展。用 RNAi技術(shù)沉默親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞中的BSP，可以穩(wěn)定抑制BSP表達(dá)，有利于深入研究BSP在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制，并為實(shí)現(xiàn)以BSP為靶點(diǎn)的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療打下基礎(chǔ)。

乳腺癌細(xì)胞和骨基質(zhì)的粘附是引起特異性骨轉(zhuǎn)移的前提之一。BSP可能通過調(diào)節(jié)粘附過程影響骨轉(zhuǎn)移，但目前國(guó)內(nèi)外均未見有關(guān)BSP基因沉默與乳腺癌細(xì)胞骨基質(zhì)粘附關(guān)系的報(bào)道。腫瘤細(xì)胞與小鼠顱骨的粘附模型[5,8]可以體外模擬人乳腺癌細(xì)胞親骨轉(zhuǎn)移的粘附過程，用于檢測(cè)細(xì)胞與骨的粘附能力，同時(shí)避免了異種移植引起的免疫反應(yīng)。本研究將 3株乳腺癌細(xì)胞分別置于經(jīng)膠原酶消化的骨片表面培養(yǎng)，體外檢測(cè)其粘附能力，證實(shí)穩(wěn)定沉默BSP基因可抑制親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞與骨基質(zhì)粘附，抑制率約48.53%。由于骨基質(zhì)主要由I型膠原和非膠原蛋白組成，而乳腺癌一般不會(huì)發(fā)生以膠原為主要成分的組織轉(zhuǎn)移 (如韌帶、皮膚) 因此推測(cè)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是通過腫瘤細(xì)胞與骨礦物質(zhì)或破骨細(xì)胞結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。小鼠骨片經(jīng) I型膠原酶消化后，骨組織細(xì)胞充分暴露，有利于與乳腺癌細(xì)胞相互作用，發(fā)生粘附。底層瓊脂的加入可避免腫瘤細(xì)胞貼壁發(fā)生，可更好地模擬體內(nèi)環(huán)境。

掃描電子顯微鏡可用于觀察細(xì)胞表面形態(tài)，但未見將其應(yīng)用于觀察骨表面粘附腫瘤細(xì)胞的表面形態(tài)的報(bào)道，將之用于BSP基因沉默的親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞及其親代細(xì)胞的觀察也屬首次。結(jié)果顯示沉默BSP并不能完全抑制親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞粘附到骨基質(zhì)表面，但是與親代細(xì)胞和 Scrambled細(xì)胞相比粘附細(xì)胞量有所減少。由于細(xì)胞分散不是十分均勻，且觀察視野有限，因此不能作為定量指標(biāo)。部分乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)團(tuán)粘附，緊密粘附細(xì)胞在骨片表面伸展成梭形，底層細(xì)胞與骨表面緊密粘附，上層細(xì)胞通過與底層細(xì)胞的連接固定于骨片表面。乳腺癌細(xì)胞表面密布小突起和泡狀結(jié)構(gòu)，通過表面伸出的絲狀結(jié)構(gòu)緊密粘附于骨表面。BSP沉默還導(dǎo)致了部分細(xì)胞表面形態(tài)的改變。粘附細(xì)胞可造成周圍骨質(zhì)的明顯破壞，但由于培養(yǎng)時(shí)間較短和腫瘤細(xì)胞的遮蓋，未見明顯的骨吸收陷窩。

裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果有力地印證了上述結(jié)論。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生包含血管內(nèi)滲、侵襲和粘附等多個(gè)環(huán)節(jié)，通過RNAi技術(shù)沉默BSP基因可以有效抑制親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移灶。

BSP基因沉默影響其與骨基質(zhì)粘附可能原因有多種，本實(shí)驗(yàn)用 MTS法證實(shí)了BSP基因沉默可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。TGF-β和 RANKL是影響骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程的重要細(xì)胞因子，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞與破骨細(xì)胞相互作用，促進(jìn)溶骨性骨轉(zhuǎn)移。Nam等[11]用抗TGF-β單克隆抗體處理乳腺癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞中BSP表達(dá)下調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)顯示敲除BSP基因能夠抑制TGF-β誘導(dǎo)局部膠原蛋白的降解和腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。而且BSP Mab[5]和BSP基因沉默對(duì)骨基質(zhì)中TGF-β1和RANKL的分泌均具有抑制作用。因此，對(duì)這一環(huán)節(jié)的影響也可能是BSP基因沉默抑制骨基質(zhì)粘附的重要途徑之一。此外，由于BSP的酸性多聚谷氨酸區(qū)域可提供與礦化基質(zhì)結(jié)合的空間，RGD序列可與αVβ3結(jié)合，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞與骨組織粘附發(fā)生，活化破骨細(xì)胞產(chǎn)生溶骨性骨吸收，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程[14]。BSP還能夠促進(jìn)體外破骨細(xì)胞表達(dá)并激活破骨細(xì)胞分化標(biāo)志物(如Cathepsin K、TRAP和NFAT2)，加速以自分泌方式進(jìn)行的破骨細(xì)胞分化，進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌的溶骨性骨轉(zhuǎn)移[3]。但是其具體的調(diào)控機(jī)制目前不是十分清晰，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Inhibitory effect of bone sialoprotein silencing on the adhesion ability of breast cancer cells to bone matrix

Li Wang1,2, Jie Wang2, Demeng Yang1,2, Chuanhong Yang2, Bing Xia2, Jiangtao Wang2,and Jiang Xian2
1 School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China
2 Department of Medical Research, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China

Received: June 21, 2010; Accepted: September 25, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30700127), Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (No. 08JJ3087).

Corresponding author: Zhonghua Liu. Tel: +86-731-8872556; Fax: +86-731-8861304; E-mail: liuzh@hunnu.edu.cn

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