李沫，賈燕濤，方榮祥

1 中國科學(xué)院微生物研究所 植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 國家植物基因研究中心，北京 100101

3 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

翻譯后修飾可能影響黃瓜花葉病毒2b蛋白抑制子活性及穩(wěn)定性

李沫1,3，賈燕濤1,2，方榮祥1,2

1 中國科學(xué)院微生物研究所 植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 國家植物基因研究中心，北京 100101

3 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

黃瓜花葉病毒 (Cucumber mosaic virus，CMV) 編碼的2b蛋白具有RNA沉默抑制子功能，為了研究翻譯后修飾對2b功能的影響，利用反向PCR定點(diǎn)突變方法對CMV-Q株系2b蛋白的1個(gè)預(yù)測的磷酸化位點(diǎn) (S40) 和2個(gè)預(yù)測的泛素化/SUMO化位點(diǎn) (K22，K39) 進(jìn)行了點(diǎn)突變，同時(shí)將點(diǎn)突變體插入植物表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌共注射法對3個(gè)2b突變體的抑制子活性進(jìn)行了分析，結(jié)果證明，當(dāng)S40突變?yōu)锳 (2bS40A) 后，2b抑制局部和系統(tǒng)沉默的活性均大幅降低；當(dāng)K22突變?yōu)镽 (2bK22R) 后，2b的抑制子活性無明顯變化；而將K22和K39均突變?yōu)镽 (2bK22R/K39R) 后，2b抑制系統(tǒng)沉默的活性則大幅減弱。對葉片中2b突變體的蛋白含量的Western blotting檢測表明，與野生型2b蛋白相比，2bK22R在植物中積累水平變化不大，而2bS40A和2bK22R/K39R的蛋白積累量則明顯降低，說明K39和S40位點(diǎn)在維持2b蛋白的抑制子活性及其在植物細(xì)胞中的穩(wěn)定性方面起重要作用。

黃瓜花葉病毒，2b蛋白，翻譯后修飾，抑制子活性，蛋白穩(wěn)定性

Abstract:To gain insights into the function of potential post-translational modifications on the activity of the Cucumber mosaic virus (CMV)-encoded silencing suppressor protein 2b, one predicted phosphorylation site (S40) and two predicted ubiquitination/sumoylation sites (K22 and K39) in CMV-Q2b protein were individually or simultaneously mutated by site-directedmutagenesis methods. These Q2b mutants were inserted into plant expression vectors, expressed in plant leaves, and then analyzed for their silencing suppressor activities. The results showed that S40A mutation greatly impaired both the local and systemic silencing suppressor activity, and the K22R mutation has no significant effect on the suppressor activity, while the K22R/K39R double mutation reduced the systemic silencing suppressor activity. To test if the decrease of suppressor activity were due to protein accumulation changes, western blot were performed to moniter the protein level of Q2b mutants. The results indicated that mutations of both K22 and K39 to R or S40 to A all significantly reduced the accumulation of the Q2b protein in plants, while the single mutation of K22 to R did not alter the accumulation of Q2b protein, suggesting that two potential post-translational modification sites, K39 and S40, contribute to the suppressor activity and stability of 2b protein in plant cells.

Keywords:Cucumber mosaic virus, 2b protein, post-translational modifications, suppressor activity, protein stability

黃瓜花葉病毒 (Cucumber mosaic virus，CMV)是雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬的典型成員，為單鏈正義三分體 RNA病毒[1-2]，是寄主種類最多、分布最廣、對農(nóng)作物危害最為嚴(yán)重的植物病毒之一。CMV RNA2編碼的2b蛋白通過RNA2產(chǎn)生的亞基因組 RNA4A表達(dá)[3]。RNA沉默系統(tǒng)是植物重要的抗病毒防御機(jī)制，針對這套防御機(jī)制，病毒進(jìn)化出抑制子蛋白來幫助自身成功侵染寄主。2b是 CMV的RNA沉默抑制子[4]，可以抑制寄主RNA沉默系統(tǒng)對病毒RNA的降解，促進(jìn)病毒在寄主植物內(nèi)的長距離運(yùn)動[5]和細(xì)胞間運(yùn)動[6]，還可抑制水楊酸介導(dǎo)的病毒抗性[7]，干擾 RNA引發(fā)的 DNA甲基化[8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道2b可以通過與AGO1蛋白相互作用抑制其對 RNA剪切來行使抑制子功能[9]，或結(jié)合小分子RNA[10-11]和 AGO4蛋白[12]從而抑制 RNA沉默。這些研究為闡明2b的功能機(jī)理提供了證據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，2b蛋白序列中的一些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域和氨基酸位點(diǎn)能夠影響2b的活性。將CMV Q株系2b(Q2b) 中22KRRRRR27序列全部用 A替換，則抑制系統(tǒng)沉默的活性喪失[13]；將 CMV Fny株系 2b(Fny2b) 序列中22KKQRRR27、33RRER36和39KSPSE43中的任一區(qū)段缺失，突變體均不能抑制局部沉默，并且結(jié)合 siRNA能力減弱[12]；CMV SD株系 2b(SD2b) 缺失64ELIEMYHH71區(qū)段后，抑制子活性僅為缺失前的1/18[14]；將CMV CM95R株系編碼的2b蛋白序列中R46突變?yōu)镃后，抑制子活性減弱，結(jié)合siRNA能力減弱[11]。抑制子活性減弱往往伴隨結(jié)合siRNA能力的減弱，由此可見，與siRNA結(jié)合是2b行使抑制子功能的一個(gè)重要途徑。

Q2b是比較弱的RNA沉默抑制子。Q2b蛋白序列中的39KSPSE43區(qū)段是一個(gè)保守的CKⅡ磷酸化識別基序[13]，在幾乎所有2b蛋白序列中都存在，預(yù)測S40位點(diǎn)可能為磷酸化修飾位點(diǎn)。磷酸化是植物蛋白最主要的翻譯后修飾，在防御信號級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用。Q2b中僅含 2個(gè)賴氨酸殘基 (K22，K39)，分別位于核定位信號區(qū)[13,15]和磷酸化區(qū)[13]。賴氨酸往往是泛素化或 SUMO化等翻譯后修飾位點(diǎn)，被修飾蛋白的功能活性常常通過亞細(xì)胞定位改變或蛋白降解等過程得以調(diào)控。為了研究植物翻譯后修飾系統(tǒng)是否通過針對2b的修飾而抑制2b活性、保護(hù)自身不被病毒感染，或者 CMV是否利用寄主植物的翻譯后修飾系統(tǒng)激活 2b的活性幫助病毒感染，將上述S40、K22和K39位點(diǎn)分別突變，并對突變體的功能活性進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示，這些潛在翻譯后修飾位點(diǎn)參與調(diào)控Q2b的抑制子活性及蛋白穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本名煙Nicotiana benthamiana種子為本實(shí)驗(yàn)室保存，GFP轉(zhuǎn)基因本名煙株系16c種子為英國劍橋大學(xué)植物學(xué)系Dr. David Baulcombe惠贈。所有植物都在土中萌發(fā)，之后移入小盆，在溫室中培養(yǎng)，溫度25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。待生長有5~6片成熟葉片時(shí)即可用于農(nóng)桿菌注射。

1.2 質(zhì)粒載體與菌株

含Q2b表達(dá)框的載體p35S-Q2b-3HA為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。二元載體pCAMBIA1300和含有GFP表達(dá)框 (35S:GFP) 的二元載體pCAMBIA1302為Dr. R.Jefferson惠贈。大腸桿菌菌株 E. coli JM109、XL-BLUE和農(nóng)桿菌菌株A. tumefaciens EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 Q2b定點(diǎn)突變體表達(dá)載體的構(gòu)建

基因定點(diǎn)突變試劑盒購自STRATAGENE。按使用說明設(shè)計(jì)引物，以 p35S-Q2b-3HA為模板進(jìn)行反向PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 0 min，24個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min ；4 ℃5 min。所得產(chǎn)物用Dpn I消化，37 1℃ h，轉(zhuǎn)化XL-BLUE感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素 (100 μg/mL)的LB平板上篩選陽性克隆，測序確定是否正確突變。

從正確克隆提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ消化，從瓊脂糖凝膠中回收含C末端3HA標(biāo)簽的Q2b及其突變體表達(dá)框片段，與用Hind Ⅲ消化的pCAMBIA1300載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素(50 μg/mL) 的LB平板上篩選陽性克隆，菌落PCR并提質(zhì)粒Hind Ⅲ酶切鑒定其是否正確。正確克隆即為C末端含有3HA標(biāo)簽的Q2b及其定點(diǎn)突變體的植物表達(dá)載體。本文中所指的Q2b及其突變體蛋白均含有C末端3HA標(biāo)簽。

1.4 農(nóng)桿菌注射及GFP觀察記錄

用重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌 EHA105感受態(tài)細(xì)胞，在含利福平 (30 μg/mL) 和卡那霉素(50 μg/mL) 的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，菌落PCR鑒定正確后，轉(zhuǎn)入含利福平 (30 μg/mL) 和卡那霉素(50 μg/mL) 的液體 LB 培養(yǎng)基，28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取20 μL轉(zhuǎn)入3 mL新鮮液體LB培養(yǎng)基 (含卡那霉素 50 μg/mL，MES 10 mmol/L，乙酰丁香酮 20 μmol/L)，28 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng) 12 h。3 000 r/min離心10 min收集菌體，用接種緩沖液(10 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L MES pH 5.6，100 μmol/L乙酰丁香酮) 重懸，調(diào)整菌液濃度至OD600為1.0。25 ℃靜置3 h后注射葉片。選擇本名煙或16c植物頂端第2片和第3片平展的葉片，用無針頭的針管將菌液注入葉片背面表皮。注射后的植物繼續(xù)在25 ℃、16 h光照、8 h黑暗條件下培養(yǎng)。用 100 W 的手提長波長紫外燈 (CA Black Ray model B 100AP) 于暗處照射注射葉片和整株植物，觀測GFP的綠色熒光。使用Canon EOS400D數(shù)碼相機(jī)拍照，鏡頭加UV鏡和黃色濾光片。

1.5 Western blotting分析

提取葉片總蛋白，用10% Bis-Tris-聚丙烯酰胺凝膠在MES-SDS電泳緩沖液中進(jìn)行電泳分離，將膠內(nèi)蛋白濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜 (Millipore) 上，條件為恒壓80 V，100 min。用抗GFP的兔來源多克隆抗體或抗 HA的鼠來源單克隆抗體孵育，再用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠抗體 (Promega) 孵育。用BCIP/NBT系統(tǒng) (Promega) 顯色。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次以上，選擇其中最顯著的效果圖。

2 結(jié)果

2.1 S40位點(diǎn)突變后Q2b抑制子活性下降

通過農(nóng)桿菌共注射將GFP和Q2b或Q2bS40A在野生型本名煙葉片中共表達(dá)，3 d后在紫外光下拍照記錄注射葉片中 GFP的表達(dá)情況以檢測 Q2b及Q2bS40A抑制局部沉默的活性[4,16]，并通過 Western blotting檢測葉片浸潤部位中的GFP表達(dá)量。結(jié)果顯示，當(dāng)S40突變?yōu)锳后，Q2bS40A抑制局部沉默的活性大幅削弱 (圖1)。與單獨(dú)表達(dá)GFP的葉片相比，與 Q2b共表達(dá)的 GFP熒光明顯更強(qiáng)，說明野生型Q2b具有抑制子活性。而與 Q2bS40A共表達(dá)的 GFP熒光和與Q2b共表達(dá)的GFP熒光相比減弱許多，接近于單獨(dú)表達(dá)的GFP熒光 (圖1A)。同時(shí)，Western blotting結(jié)果也同樣顯示，與Q2bS40A共表達(dá)的GFP蛋白積累量明顯少于與 Q2b共表達(dá)的 GFP蛋白(圖 1B)。其中野生型本名煙葉片被用作陰性對照(CK-)，轉(zhuǎn)GFP基因本名煙株系16c葉片被用作陽性對照 (16c)。

圖1 S40位點(diǎn)是Q2b局部沉默抑制子活性所必需Fig. 1 S40 is essential for the local silencing suppressor activity of Q2b. (A) GFP fluorescence co-expressed with Q2bS40Ais weaker than that co-expressed with Q2b. (B)Accumulation level of GFP co-expressed with Q2b or Q2bS40Ain Nicotiana benthamiana leaves.

通過農(nóng)桿菌共注射將GFP和Q2b或Q2bS40A在16c植物葉片中共表達(dá)，每組6~10株植物，取8 dpi、10 dpi和12 dpi這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄注射后16c植株上系統(tǒng)沉默的發(fā)生情況，平行重復(fù) 3次，計(jì)算沉默率以反映 Q2b或 Q2bS40A抑制系統(tǒng)沉默的活性[16]，在10 dpi于紫外光下拍照記錄兩組共注射植株發(fā)生系統(tǒng)沉默的情況。結(jié)果顯示，在8 dpi時(shí)Q2b抑制沉默效率接近100%，與之共表達(dá)的GFP僅使3%的16c植株發(fā)生GFP系統(tǒng)沉默，而此時(shí)Q2bS40A抑制沉默效率只有48%，即與之共表達(dá)的GFP使52%的 16c植株發(fā)生 GFP系統(tǒng)沉默；在 10 dpi時(shí)，Q2bS40A幾乎不能抑制GFP系統(tǒng)沉默，抑制沉默效率降為19%，而此時(shí)Q2b仍有88%的抑制沉默效率，只有12%的16c植株發(fā)生GFP系統(tǒng)沉默(圖 2A)。此外，在10 dpi時(shí)Q2bS40A與GFP共注射的16c植株頂部新生葉片葉脈呈紅色，顯示該處GFP發(fā)生系統(tǒng)沉默，而Q2b與GFP共注射的16c植株頂部新生葉片葉脈呈綠色，表明GFP未發(fā)生系統(tǒng)沉默(圖 2B)。

圖2 S40位點(diǎn)是Q2b抑制系統(tǒng)沉默所必需Fig. 2 S40 is essential for Q2b suppression of systemic silencing. (A) S40A mutation reduces the Q2b’s ability to suppress systemic silencing. (B) Q2b S40A mutant can not suppress systemic silencing of GFP.

綜合以上結(jié)果可知，S40位點(diǎn)對于Q2b的抑制子活性是必需的，將S40突變?yōu)锳后，Q2b抑制局部沉默和系統(tǒng)沉默的活性均大幅減弱。絲氨酸是潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)，但是，是否是由于該位點(diǎn)的磷酸化修飾影響了Q2b的抑制子活性還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

2.2 K39位點(diǎn)突變后Q2b抑制系統(tǒng)沉默活性下降

利用同樣的方法，分別檢測 Q2bK22R和Q2bK22R/K39R突變體抑制植物局部沉默和系統(tǒng)沉默的活性，與Q2b的抑制子活性進(jìn)行比較。

局部沉默活性檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K22突變?yōu)镽后，與 Q2bK22R共表達(dá)的 GFP熒光和與 Q2b共表達(dá)的GFP熒光相比差異不明顯，而當(dāng)K22和K39均突變?yōu)镽后，與Q2bK22R/K39R共表達(dá)的GFP熒光和與Q2b共表達(dá)的GFP熒光相比明顯增強(qiáng)。同時(shí)，提取葉片浸潤部位總蛋白，用GFP抗體作Western blotting檢測GFP表達(dá)量，計(jì)算4組樣品5次實(shí)驗(yàn)的GFP表達(dá)量平均值。

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，Q2bK22R抑制局部沉默的效果和Q2b相比沒有特別明顯的差異，而Q2bK22R/K39R抑制局部沉默的效果則要好于前兩者，與之共表達(dá)的GFP增加了約一倍 (圖3)。這與觀察到的GFP熒光結(jié)果接近，暗示K39位點(diǎn)可能對Q2b抑制局部沉默活性有負(fù)調(diào)控作用。

圖3 K22R與K39R突變對Q2b抑制局部沉默活性的影響Fig. 3 Influence of K22R and K39R mutation on the local silencing suppressor activity of Q2b. Q2b, Q2bK22Rand Q2bK22R/K39Rall differentially increased the accumulation levels of the co-expressed GFP proteins.

系統(tǒng)沉默抑制活性檢測結(jié)果比較復(fù)雜。從共注射植物沉默率統(tǒng)計(jì)結(jié)果中可以看到，K22R和K22R/K39R兩種突變都使得 Q2b抑制GFP系統(tǒng)沉默活性下降，沉默率在10 dpi時(shí)均超過50% (圖4B)。但是，和 Q2b一樣，Q2bK22R仍可抑制頂部新葉中GFP的沉默，使GFP沉默局限在部分葉片的葉脈部位，整株植物在紫外光下呈綠色；而Q2bK22R/K39R則不能抑制頂部新葉中GFP的沉默，整株植物在紫外光下呈紅色 (圖 4A)。因此，K39位點(diǎn)是 Q2b抑制系統(tǒng)沉默所必需的。我們推測該位點(diǎn)潛在的翻譯后修飾對Q2b抑制系統(tǒng)沉默有重要作用，但是K39位點(diǎn)單突變的影響還需進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。

2.3 K39和S40位點(diǎn)突變影響Q2b在植物中的積累量

用農(nóng)桿菌注射法將Q2b及其突變體的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入本名煙葉片，3 d后，提取葉片浸潤部位總蛋白，通過 Western blotting檢測在葉片中表達(dá)的Q2b、Q2bK22R、Q2bK22R/K39R、Q2bS40A四種蛋白的積累量，結(jié)果顯示，在浸潤葉片中，Q2bK22R和 Q2b相比沒有變化，均可以被檢測到，而Q2bK22R/K39R和Q2bS40A則不能被檢測到 (圖5)。這一結(jié)果暗示，K39和S40這2個(gè)潛在翻譯后修飾位點(diǎn)對Q2b蛋白的積累量起關(guān)鍵作用，有可能影響Q2b在植物中的穩(wěn)定性。

圖4 K39位點(diǎn)是Q2b抑制系統(tǒng)沉默所必需Fig. 4 K39 is essential for Q2b suppression of systemic silencing. (A) K39R mutation reduces the Q2b’s ability to suppress systemic silencing of GFP. (B) K22R and K22R/K39R mutants of Q2b exhibit reduced ability to suppress systemic silencing.

圖5 K39和S40位點(diǎn)是Q2b在植物中穩(wěn)定表達(dá)所必需Fig. 5 K39 and S40 residues are essential for stable expression of the Q2b protein in plants. Accumulation level of Q2b,Q2bK22R, Q2bK22R/K39Rand Q2bS40Ain Nicotiana benthamiana leaves.

3 討論

目前CMV編碼的2b蛋白作為RNA沉默抑制子已研究得較為深入，其行使功能的部分機(jī)理包括與AGO蛋白結(jié)合及siRNA結(jié)合等功能也得到揭示，但是在蛋白質(zhì)翻譯后修飾對其功能影響方面的研究還很少。本研究著重對2b蛋白的潛在翻譯后修飾位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)位點(diǎn)對2b蛋白的沉默抑制子功能至關(guān)重要。其中，S40位點(diǎn)對Q2b抑制局部沉默和系統(tǒng)沉默的活性都很重要，將其變?yōu)锳后，Q2bS40A抑制子活性大幅下降；另外，K39位點(diǎn)對Q2b抑制系統(tǒng)沉默活性也很重要，將其變?yōu)镽后，Q2b抑制系統(tǒng)沉默活性基本喪失。

絲氨酸是常見的磷酸化修飾位點(diǎn)，將絲氨酸突變?yōu)楸彼峥梢宰钄嘣撐稽c(diǎn)的磷酸化修飾。磷酸化對于植物病毒運(yùn)動蛋白在細(xì)胞間運(yùn)動是必要的[17]，Q2b也被認(rèn)為具有部分運(yùn)動蛋白的功能[5-6]，因此，Q2bS40A減弱的抑制子活性可能是因?yàn)榱姿峄揎棻蛔钄嘤绊?b蛋白在細(xì)胞間運(yùn)動所造成的結(jié)果。而賴氨酸是泛素化或SUMO化等翻譯后修飾發(fā)生的位點(diǎn)，將賴氨酸替換為結(jié)構(gòu)類似的精氨酸后并不會很大程度上影響蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，但是其泛素化或SUMO化等翻譯后修飾則被阻斷。若該位點(diǎn)的賴氨酸為多聚泛素化修飾位點(diǎn)，突變?yōu)榫彼岷髸?dǎo)致蛋白不能被泛素-蛋白酶體途徑降解，積累量將提高；若該位點(diǎn)的賴氨酸為單泛素化修飾位點(diǎn)，則突變?yōu)榫彼岷髸淖兊鞍椎亩ㄎ换蚧钚浴Ｔ谖覀兊难芯拷Y(jié)果中，K39突變?yōu)镽后，2b蛋白積累量下降，因此推測該突變可能阻斷了單泛素化或SUMO化修飾，引發(fā)Q2b的蛋白定位或活性發(fā)生改變，使Q2b抑制系統(tǒng)沉默的活性減弱。

本研究結(jié)果證明，Q2b的潛在翻譯后修飾位點(diǎn)對其抑制子活性非常重要。其中一種可能性是影響其在植物中的積累水平。因?yàn)楫?dāng)將S40變?yōu)锳或K39變?yōu)镽后，通過Western blotting在葉片中均檢測不到Q2b蛋白的存在。此前有文獻(xiàn)報(bào)道，將CMV Fny株系編碼的2b蛋白序列中潛在磷酸化區(qū)39KSPSE43整體缺失后，2b蛋白在植物中的積累量下降，而只將S40變?yōu)锳，2b仍然能夠正常積累，相應(yīng)地，2b抑制局部沉默的活性與其在植物中的積累量相關(guān)[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，S40位點(diǎn)變?yōu)锳后，Q2b在植物中的積累量下降，抑制子活性也減弱；K39位點(diǎn)變?yōu)?R后，Q2b在植物中的積累量下降，但只有抑制系統(tǒng)沉默的活性減弱，抑制局部沉默的活性似乎還有增強(qiáng)。這就說明除了蛋白積累量之外還有其他因素在影響Q2b的抑制子活性，我們推測該突變可能改變Q2b的翻譯后修飾狀態(tài)，有利其與RNA沉默效應(yīng)元件作用，從而增強(qiáng)其抑制局部沉默的活性。

CMV 2b蛋白的穩(wěn)定性較差，無論在體內(nèi)還是體外都不容易檢測純化，這給針對它的研究工作帶來不少困難，全長2b蛋白的晶體結(jié)構(gòu)至今未能被解出。我們的工作立足于蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在找出對2b功能有影響的潛在翻譯后修飾位點(diǎn)后，最終的目標(biāo)是明確2b蛋白在植物中的翻譯后修飾狀態(tài)。目前，檢測2b蛋白翻譯后修飾狀態(tài)的有效方法仍在探索中，我們期待今后能夠在這方面有所突破，從而揭示翻譯后修飾調(diào)控2b功能活性的分子機(jī)理。

REFERENCES

[1] Peden KWC, Symons RH. Cucumber mosaic virus contains a functionally divided genome. Virology, 1973,53(2): 487?492.

[2] Lot H, Marchoux G, Marrow J. Evidence for three functional RNA species in several strains of cucumber mosaic virus. J Gen Virol, 1974, 22(1): 81?93.

[3] Ding SW, Anderson BJ, Haase HR, et al. New overlapping gene encoded by the cucumber mosaic virus genome.Virology, 1994, 198(1): 593?601.

[4] Brigneti G, Voinnet O, Li WX, et al. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J, 1998, 17(22):6739?6746.

[5] Ding SW, Li WX, Symons RH. A novel naturally occurring hybrid gene encoded by a plant RNA virus facilitates long distance virus movement. EMBO J, 1995,14(23): 5762?5772.

[6] Shi BJ, Miller J, Symons RH, et al. The 2b protein of cucumoviruses has a role in promoting the cell-to-cell movement of pseudorecombinant viruses. Mol Plant Microbe Interact, 2003, 16(3): 261?267.

[7] Ji LH, Ding SW. The suppressor of transgene RNA silencing encoded by cucumber mosaic virus interferes with salicylic acid-mediated virus resistance. Mol Plant Microbe Interact, 2001, 14(6): 715?724.

[8] Guo HS, Ding SW. A viral protein inhibits the long range signaling activity of the gene silencing signal. EMBO J,2002, 21(3): 398?407.

[9] Zhang XR, Yuan YR, Pei Y, et al. Cucumber mosaic virus-encoded 2b suppressor inhibits Arabidopsis Argonaute1 cleavage activity to counter plant defense.Genes Dev, 2006, 20(23): 3255?3268.

[10] Li F, Ding SW. Virus counterdefense: diverse strategies for evading the RNA-silencing immunity. Annu Rev Microbiol, 2006, 60: 503?531.

[11] Goto K, Kobori T, Kosaka Y, et al. Characterization of silencing suppressor 2b of cucumber mosaic virus based on examination of its small RNA-binding abilities. Plant Cell Physiol, 2007, 48(7): 1050?60.

[12] González I, Martíne L, Rakitina DV, et al. Cucumber mosaic virus 2b protein subcellular targets and interactions: their significance to RNA silencing suppressor activity. Mol Plant Microbe Interact, 2010,23(3): 294?303.

[13] Lucy AP, Guo HS, Li WX, et al. Suppression of post-transcriptional gene silencing by a plant viral protein localized in the nucleus. EMBO J, 2000, 19(7):1672?1680.

[14] Ye J, Qu J, Zhang J, et al. A critical domain of the Cucumber mosaic virus 2b protein for RNA silencing suppressor activity. FEBS Lett, 2009, 583(1): 101?106.

[15] Wang Y, Tzfira T, Gaba V, et al. Functional analysis of the Cucumber mosaic virus 2b protein: pathogenicity and nuclear localization. J Gen Virol, 2004, 85(10):3135?3147.

[16] Hamilton A, Voinnet O, Chappell L, et al. Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. EMBO J, 2002,21(17): 4671?4679.

[17] Ding B, Li QB, Nguyen L, et al. Cucumber mosaic virus 3a protein potentiates cell-to-cell trafficking of CMV RNA in tobacco plants. Virology, 1995, 207(2): 345?353.2000, 10(1/3): 257?262.

[22] Arakawa T, Timasheff SN. Mechanism of polyethylene glycol interaction with proteins. Biochemistry, 1985,24(24): 6756?6762.

[23] Greenfield NJ, Fasman GD. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation.Biochemistry, 1969, 8(10): 4108?4116.

[24] Citovsky V, Yanai P, Loyter A. The use of circular dichroism to study conformational changes induced in Sendai virus envelope glycoproteins. Acorrelation with the viral fusogenic activity. J Biol Chem, 1986, 261(5):2235?2239.

[25] Lu RC, Cao AN, Lai LH, et al. Effect of cationic surfactants on the interaction between sodium perfluorooctanoate and β-lactoglobulin. J Colloid Interface Sci, 2006, 293(1):61?68.

[26] Shen Q, Huang B, Shao JL, et al. Mechanism discussion of interaction between enzyme and several compounds with circular dichroism method. J Sun Yatsen Univ, 2006,45(4): 62?64.

沈瓊, 黃濱, 邵嘉亮, 等. 運(yùn)用圓二色譜研究酶與化合物相互作用的機(jī)理. 中山大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 45(4): 62?64.

[27] Andrade MA, Chacón P, Merelo JJ, et al. Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism spectra using an unsupervised learning neural network. Protein Eng, 1993, 6(4): 383?390.

[28] Lu RC, Cao AN, Lai LH, et al. Protein-surfactant interaction: differences between fluorinated and hydrogenated surfactants. Colloids Surfaces B:Biointerfaces, 2008, 64(1): 98?103.

[29] Bischof JC, He XM. Thermal stability of proteins. Ann N Y Acad Sci, 2006, 1066: 12?33.

Implication of post-translational modifications in suppressor activity and stability of the Cucumber mosaic virus 2b protein

Mo Li1,3, Yantao Jia1,2, and Rongxiang Fang1,2
1 State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
2 National Center for Plant Gene Research, Beijing 100101, China
3 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Received: May 4, 2010; Accepted: August 18, 2010

Corresponding author: Xunli Liu. Tel: +86-538-8249131; E-mail: xlliu@sdau.edu.cn