周啟升，劉訓(xùn)理，張楠，宋振，仇念全，張本峰，國輝，呂常旭，于建

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，泰安 271018

2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018

拮抗鏈霉菌S24發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及其對黃曲霉的抑菌作用

周啟升1，劉訓(xùn)理1，張楠2，宋振2，仇念全1，張本峰1，國輝2，呂常旭1，于建1

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，泰安 271018

2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018

拮抗鏈霉菌 S24對黃曲霉、赭曲霉、黑曲霉等糧食和飼料中常見的曲霉菌具有廣譜抗性。優(yōu)化了該菌株抗菌物質(zhì)高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基配方，并分析該菌株產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)對黃曲霉的抑菌作用。通過單次單因子試驗(yàn)、正交試驗(yàn)，對S24菌株抗菌物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，利用顯微鏡觀察，研究了S24菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對黃曲霉菌絲及孢子的抑制作用。獲得適合S24菌株抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基配方為：淀粉10 g、葡萄糖40 g、黃豆餅粉24 g、酵母浸膏粉8 g、KH2PO44 g、CaCO30.8 g、水 1 L。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液效價(jià)達(dá)到10 235.45 μg/mL，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了280.67%；S24菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)能夠有效抑制黃曲霉菌絲的生長及孢子的萌發(fā)，抗菌物質(zhì)作用于菌絲后，菌絲出現(xiàn)變粗、扭曲、皺褶、膨大、內(nèi)容物流出、消融等現(xiàn)象；作用于黃曲霉孢子后，孢子出現(xiàn)聚集、內(nèi)容物分布不均、變形、空腔及孢壁斷裂等異常。

鏈霉菌，發(fā)酵，培養(yǎng)基優(yōu)化，抑菌作用

Abstract:Streptomyces S24 has broad spectrum against Aspergillus spp. in food and feed, such as Aspergillus flavus, Aspergillus niger and Asperegillus alutacells. The objective of this study was to improve the production of antifungal substances produced by S24 and to test their inhibitory effects on Aspergillus flavus. By using one-factor-at-a-time experiment and orthogonal design method,we optimized the fermentation medium. The composition of an optimized medium for the production of antifungal substances contained (g/L): starch soluble, 10; Glucose, 40; yeast extract, 8; soybean powder, 24; KH2PO44; and CaCO30.8. As a result, the productivity of antifungal substances could reach to 10 235.45μg/mL, and this value was 2.81 times higher than that of initialmedium before optimization. Additionally, inhibitory effects of the products on Aspergillus flavus were analyzed. Antagonistic tests indicated that the antifungal substances greatly inhibited mycelium growth and spores germination of Aspergillus flavus. We observed through microscope that the mycelia grew abnormally, such as contorting, bulging, vacuole increasing and the cytoplasmic contents inside effusing and the spores appeared unusual, such as gathering, deforming, cytoplasmic contents inside effusing and fracturing.

Keywords:Streptomyces, fermentation, medium optimization, inhibitory effect

黃曲霉 Aspergillus flavus屬于曲霉屬真菌，是很多作物的腐生菌或致壞死病原菌，依靠產(chǎn)生的分生孢子和菌核在作物中交叉感染，侵染糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料等，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，威脅人、畜和禽類健康。黃曲霉最大的危害是產(chǎn)生黃曲霉毒素 (Aflatoxins)，黃曲霉毒素具有很強(qiáng)的毒性，被認(rèn)為有致癌性、致突變、致畸性、抑制免疫力，并可引起肝部損傷等危害，其中毒性最大的黃曲霉毒素Bl，其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍[1-2]。許多國家都限定了食品和飼料中黃曲霉毒素的最高含量，歐盟規(guī)定農(nóng)作物中的黃曲霉毒素B1的含量不得高于2 μg/kg，總毒素含量不高于 4 μg/kg[3]，因此如何有效地防治黃曲霉及其毒素的產(chǎn)生具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。以往防治黃曲霉及其毒素污染的方法主要是用物理、化學(xué)和生物學(xué)方法防止黃曲霉的生長及清除食品中已污染的毒素，這些方法不僅成本高，而且效果并不理想[4]。目前國內(nèi)外相關(guān)研究主要集中在對黃曲霉的生物防治，包括從植物或微生物中提取抗菌物質(zhì)抑制黃曲霉生長或產(chǎn)毒，以及利用微生物的競爭、拮抗作用抑制黃曲霉生長或者對黃曲霉毒素進(jìn)行降解[5]。從食品安全角度考慮利用微生物之間的拮抗作用，探索生物控制方法以預(yù)防黃曲霉的生長與產(chǎn)毒具有重要意義。

拮抗鏈霉菌S24由本實(shí)驗(yàn)室從泰山林地土壤中分離獲得，該菌株對黃曲霉、赭曲霉、黑曲霉等糧食和飼料中常見的曲霉菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，該菌株鑒定為白網(wǎng)鏈霉菌 Streptomyces albireticuli近似種，已在GenBank注冊，注冊號為FJ596182。該菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)粗物對黃曲霉的最低抑菌濃度為19.06 μg/mL[6]。初步研究發(fā)現(xiàn)該抗菌物質(zhì)為一組多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，性質(zhì)穩(wěn)定且提取方法簡單，大孔吸附樹脂AB-8對其有較大的吸附量，且容易吸附解吸[7]。抗菌物質(zhì)經(jīng)有機(jī)溶劑抽提、硅膠柱層析、反相高效液色譜 (RP-HPLC) 分離共獲得 2種四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，6種五烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。本研究對S24菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了抗菌物質(zhì)對黃曲霉抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

S24菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。現(xiàn)已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)，專利菌種保藏編號為CGMCC 3503。抗菌物質(zhì)效價(jià)測定指示菌：黃曲霉Aspergillus flavus由國家糧食局科學(xué)研究院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

S24菌株活化培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20.0 g，NH4NO31.0 g，硫酸鎂1.0 g，KH2PO40.6 g，瓊脂16.0 g，水1 L；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：淀粉2.5 g，葡萄糖16.0 g，蛋白胨10.0 g，玉米漿1.0 g，NaCl 7.5 g，(NH4)2SO44.0 g，水1 L；種子發(fā)酵培養(yǎng)基同基礎(chǔ)培養(yǎng)基；發(fā)酵液效價(jià)生測培養(yǎng)基同菌株活化培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器

SPX型智能生化培養(yǎng)箱 (江南儀器廠)；光學(xué)顯微鏡 (Olympus)；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 (太倉儀器廠)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (Heraeus)。

1.2 S24菌株搖瓶培養(yǎng)及抗菌物質(zhì)粗物的制備

種子液的制備：將S24斜面菌種接種到活化培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d，用打孔器打取菌塊2個(gè)接種到種子培養(yǎng)基中，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。

搖瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基121 ℃濕熱滅菌20 min，種子液以2%的接種量接種到50 mL/250 mL三角瓶中，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h。

抗菌物質(zhì)粗物的制備：發(fā)酵液 100 ℃滅菌10 min，低速大容量多管離心機(jī)4 200 r/min離心30 min，上清液經(jīng)大孔吸附樹脂AB-8吸附后，85%丙酮解吸，解吸液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥得到抗菌物質(zhì)粗物[11]。

1.3 發(fā)酵液效價(jià)的測定

黃曲霉孢子懸液的制備：黃曲霉在PDA培養(yǎng)基上 28 ℃培養(yǎng) 5 d后，用 pH為 7.0的磷酸緩沖液(PBS) 將孢子從培養(yǎng)基上洗下，經(jīng)漩渦混合器振蕩20~40 s，雙層無菌紗布過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

生測平板的制備：生測培養(yǎng)基熔化后，溫度降至 50 ℃~55 ℃時(shí)，加入黃曲霉孢子懸液，使孢子的濃度為2×104~4×104CFU/mL，將培養(yǎng)基孢子懸液倒入培養(yǎng)皿，20 mL/培養(yǎng)皿，制備混菌平板。

發(fā)酵液效價(jià)的測定：采用牛津杯法[8]。發(fā)酵液100 ℃滅菌 10 min，加入牛津杯中 (250 μL/孔)，28 ℃培養(yǎng)18 h，十字交叉法測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈的直徑大小計(jì)算其效價(jià)，發(fā)酵液效價(jià)計(jì)算公式[7]：y=10(x+10.931)/10.797×n〔y：發(fā)酵液效價(jià) (μg/mL)；x：抑菌圈直徑 (10.5 mm＜x＜18.0 mm)；n：稀釋倍數(shù)〕。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.4.1 不同有機(jī)氮源對發(fā)酵液效價(jià)的影響

用蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏、黃豆餅粉、玉米漿、尿素 6種有機(jī)氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源，濃度分別為0.8%、1.6%、0.8%、1.6%、1.6%和 0.2%，其他培養(yǎng)基組成同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以不加有機(jī)氮源的培養(yǎng)基 (CK1) 及基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (CK2)作為對照，每個(gè)處理 2個(gè)重復(fù)。測定發(fā)酵液效價(jià)，比較不同有機(jī)氮源對發(fā)酵液效價(jià)的影響。

1.4.2 不同無機(jī)氮源對發(fā)酵液效價(jià)的影響

用 (NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3、NH4Cl 4 種無機(jī)氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機(jī)氮源，濃度分別為0.8%、0.48%、0.32%和1.0% (氮素含量基本相同)，以 1.4.1篩選出的最佳有機(jī)氮源組合作為發(fā)酵培養(yǎng)基有機(jī)氮源，其他培養(yǎng)基組成同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以不加無機(jī)氮源的培養(yǎng)基作為對照，每個(gè)處理 2個(gè)重復(fù)。測定發(fā)酵液效價(jià)，比較不同無機(jī)氮源對發(fā)酵液效價(jià)的影響。

1.4.3 不同碳源對發(fā)酵液效價(jià)的影響

用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、玉米粉、甘露糖 7種碳源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，濃度均為2.0%，以篩選出的最佳氮源作為發(fā)酵氮源，其他的培養(yǎng)基組成同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以不加碳源的培養(yǎng)基作為對照，每個(gè)處理 2個(gè)重復(fù)。測定發(fā)酵液效價(jià)，比較不同碳源對發(fā)酵液效價(jià)的影響。

1.4.4 不同C/N比對發(fā)酵液效價(jià)的影響

以 1.4.1~1.4.3篩選出的最佳碳源 (淀粉、葡萄糖) 和氮源 (黃豆餅粉、酵母浸膏粉) 為因素，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平，采用L16(45) 正交試驗(yàn)，對碳、氮源的濃度進(jìn)行優(yōu)化，其中各因素及水平見表 1，其他的培養(yǎng)基組成同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)。測定發(fā)酵液效價(jià)。利用 SAS9.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較不同碳、氮源濃度對發(fā)酵液效價(jià)的影響。

表1 L16(45) 正交試驗(yàn)中因素與水平的設(shè)置Table 1 Arrangement of factors and levels of orthogonal L16(45)

1.4.5 不同無機(jī)鹽對發(fā)酵液效價(jià)的影響

考察 4 種無機(jī)鹽 CaCO3、MgSO4、KH2PO4、NaCl對發(fā)酵液效價(jià)的影響。根據(jù)正交表L16(45) 進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素與水平的設(shè)置見表2，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)。測定發(fā)酵液效價(jià)，比較不同無機(jī)鹽對發(fā)酵液效價(jià)的影響。

表2 L16(45) 正交試驗(yàn)中因素與水平的設(shè)置Table 2 Arrangement of factors and levels of orthogonal L16(45)

1.4.6 無機(jī)鹽營養(yǎng)限制試驗(yàn)

根據(jù)無機(jī)鹽的正交試驗(yàn)結(jié)果，得到對發(fā)酵液效價(jià)影響顯著的無機(jī)鹽及其最佳水平，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行無機(jī)鹽的營養(yǎng)限制試驗(yàn)，進(jìn)一步探討不同的無機(jī)鹽及其組合對發(fā)酵液效價(jià)的影響，從中選擇出影響最敏感的因素，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)，方法參照文獻(xiàn)[9]。

1.4.7 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

選取對發(fā)酵液效價(jià)影響顯著的培養(yǎng)基因素，采用正交表 L27(313) 進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平的設(shè)置分別見表 3，每個(gè)處理 2個(gè)重復(fù)。測定發(fā)酵液效價(jià)，比較不同因素對發(fā)酵液效價(jià)的影響，篩選最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

表3 L27(313) 正交試驗(yàn)中因素與水平的設(shè)置Table 3 Arrangement of factors and levels of orthogonal L27(313)

1.4.8 發(fā)酵配方的驗(yàn)證

優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基在相同的發(fā)酵條件下發(fā)酵，每個(gè)處理 2個(gè)重復(fù)。測定發(fā)酵液效價(jià)，比較優(yōu)化前后發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵液效價(jià)的影響，驗(yàn)證發(fā)酵配方。

1.5 S24菌株及抗菌物質(zhì)對黃曲霉的抑制作用

1.5.1 S24菌株抗菌物質(zhì)粗物對黃曲霉孢子的影響

取4×MIC抗菌物質(zhì)粗物處理8、16、24 h的黃曲霉孢子懸液，用顯微鏡觀察孢子形態(tài)，以未加抗菌物質(zhì)粗物的孢子懸液為對照。

1.5.2 S24菌株對黃曲霉菌絲形態(tài)的影響

將黃曲霉菌盤接種在平板中央，在距中央2 cm處接種S24菌株，28 ℃培養(yǎng)96 h后，挑取拮抗圈邊緣的菌絲鏡檢，以正常生長的菌絲為對照，觀察黃曲霉菌絲的形態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源對發(fā)酵液效價(jià)的影響

2.1.1 不同有機(jī)氮源對發(fā)酵液效價(jià)的影響

蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、黃豆餅粉、酵母粉和尿素6種有機(jī)氮源對抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響見圖1。當(dāng)培養(yǎng)基中不添加有機(jī)氮源時(shí) (CK1)，發(fā)酵液的效價(jià)小于500 U。說明有機(jī)氮源對抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生有明顯的影響。以黃豆餅粉、酵母粉和牛肉膏作為氮源時(shí)，發(fā)酵液效價(jià)較高；蛋白胨和尿素作為氮源時(shí)，發(fā)酵液效價(jià)都較低，而以玉米漿作為有機(jī)氮源添加時(shí)檢測不到抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生。另外培養(yǎng)基中只添加一種有機(jī)氮源時(shí)發(fā)酵液效價(jià)均低于基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CK2)。說明，S24菌株對氮素營養(yǎng)有較高的要求，因此選擇產(chǎn)素水平較高的黃豆餅粉和酵母粉的混合有機(jī)氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基最佳氮源。

2.1.2 不同無機(jī)氮源對發(fā)酵液效價(jià)的影響

(NH4)2SO4、NaNO3、NH4Cl、NH4NO34 種無機(jī)氮源發(fā)酵液效價(jià)的影響見圖 2。添加任意一種無機(jī)氮源時(shí)效價(jià)均低于CK，因此發(fā)酵培養(yǎng)基中不再添加無機(jī)氮源。

圖1 不同有機(jī)氮源對發(fā)酵液效價(jià)的影響Fig. 1 Effect of different organic nitrogen on titer of fermentation broth. 1: CK1; 2: CK2; 3: soybean powder; 4:peptone; 5: yeast extract; 6: corn plasm; 7: urea; 8: beef extract.

圖2 不同無機(jī)氮源對發(fā)酵液效價(jià)的影響Fig. 2 Effect of different inorganic nitrogen on titer of fermentation broth. 1: CK; 2: (NH4)2SO4; 3: NaNO3; 4: NH4Cl;5: NH4NO3.

2.2 不同碳源對發(fā)酵液效價(jià)的影響

葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、玉米粉、麥芽糖、甘露糖7種碳源對發(fā)酵液效價(jià)的影響見圖3。7種不同碳源對發(fā)酵液效價(jià)的影響有明顯差別。當(dāng)培養(yǎng)基中不加碳源時(shí) (圖中CK) 發(fā)酵液的效價(jià)最低，說明碳源對 S24菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)起著非常重要的作用。以葡萄糖為碳源時(shí)發(fā)酵液效價(jià)最高；以緩效碳源淀粉作為碳源時(shí)發(fā)酵液效價(jià)也較高。因此，選擇淀粉和葡萄糖作為復(fù)合碳源。

圖3 不同碳源對發(fā)酵液效價(jià)的影響Fig. 3 Effect of different carbon on titer of fermentation broth.1: CK; 2: maltose; 3: sucrose; 4: starch soluble; 5: indian meal;6: glucose; 7: mannitol; 8: lactose.

2.3 不同C/N比對發(fā)酵液效價(jià)的影響

不同碳、氮源濃度對發(fā)酵液效價(jià)的影響結(jié)果見表 4，不同碳、氮源濃度對抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量有較大影響。經(jīng)SAS系統(tǒng)ANOVA過程分析，結(jié)果見表5。4個(gè)因素對發(fā)酵液效價(jià)的影響均達(dá)到極顯著水平，它們的最佳組合為：淀粉1.5%，葡萄糖4.0%，酵母粉1.2%，黃豆餅粉 2.0%。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，S24菌株的產(chǎn)素水平與碳、氮源的種類、濃度關(guān)系密切。

表4 碳、氮源濃度對發(fā)酵液效價(jià)影響的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of different carbon and nitrogen on titer of fermentation broth

表 5 碳、氮源濃度對發(fā)酵液效價(jià)影響的試驗(yàn)結(jié)果 SAS分析表Table 5 The SAS analysis result of the experiment of carbon and nitrogen source concentration

2.4 不同無機(jī)鹽對發(fā)酵液效價(jià)的影響

無機(jī)鹽對發(fā)酵液效價(jià)的影響結(jié)果見表 6。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SAS系統(tǒng)ANOVA過程分析，結(jié)果見表7，由表中Pr值得知，CaCO3、KH2PO4和NaCl對發(fā)酵液效價(jià)的影響均達(dá)極顯著水平，MgSO4的影響不顯著。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析得出 CaCO30.1%，KH2PO40.4%，NaCl 0.2% 為最佳無機(jī)鹽組合。

表 6 無機(jī)鹽對發(fā)酵液效價(jià)影響的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) (L16(45))及結(jié)果Table 6 The design and result of L16(45) orthogonal test for effect of inorganic salt on titer of fermentation broth

表7 無機(jī)鹽對發(fā)酵液效價(jià)影響試驗(yàn)結(jié)果的SAS分析表Table 7 The SAS analysis result of the experiment of inorganic salt

2.5 無機(jī)鹽營養(yǎng)限制對發(fā)酵液效價(jià)的影響

通過無機(jī)鹽營養(yǎng)限制的研究，可以尋找到對抗菌物質(zhì)產(chǎn)量影響最敏感的無機(jī)鹽及其組合。從圖 4可以看出，0.4% KH2PO4+0.1% CaCO3組合的發(fā)酵液效價(jià)最高，達(dá)到9 670 μg/mL，而其他無機(jī)鹽組合發(fā)酵液效價(jià)均降低。因此，選擇0.4% KH2PO4+0.1% CaCO3為培養(yǎng)基的無機(jī)鹽組分。

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

以葡萄糖和淀粉為最佳碳源，黃豆餅粉、酵母粉為最佳氮源，KH2PO4、CaCO3為最佳無機(jī)鹽進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果見表8，采用SAS9.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表9。從結(jié)果可以看出，

圖4 不同無機(jī)鹽組合對發(fā)酵液效價(jià)的影響Fig. 4 Effect of different combination of inorganic salt on titer of fermentation broth. 1: 0.2% NaCl; 2: 0.4% KH2PO4; 3: 0.1%CaCO3; 4: 0.2% NaCl+0.4% KH2PO4; 5: 0.2% NaCl+0.1%CaCO3; 6: 0.4% KH2PO4+0.1% CaCO3; 7: 0.2% NaCl+0.4%KH2PO4+0.1% CaCO3; 8: CK.

各因素對發(fā)酵液效價(jià)影響的程度：葡萄糖＞KH2PO4＞黃豆餅粉＞CaCO3＞淀粉＞酵母粉。葡萄糖的影響達(dá)到了極顯著的水平，KH2PO4和黃豆餅粉的影響在0.05水平上顯著，淀粉、CaCO3及酵母粉的影響不顯著。綜合各因素及其水平對發(fā)酵液效價(jià)的影響結(jié)果，得到最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖4.0%、黃豆餅粉2.4%、KH2PO40.4%、酵母粉0.8%、淀粉1.0%、CaCO30.08%。

2.7 優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基配方的驗(yàn)證

對優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證，相同的發(fā)酵條件下，優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵液效價(jià)達(dá)到10 235.45 μg/mL，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵液效價(jià)(3 646.72 μg/mL) 提高了280.67%。因此，確定淀粉10 g、葡萄糖40g、黃豆餅粉 24 g、酵母浸膏粉8 g、KH2PO44 g、CaCO30.8 g、水1 L的培養(yǎng)基組合為S24菌株發(fā)酵的最佳配方。

2.8 S24菌株及其抗菌物質(zhì)對黃曲霉的抑制作用

2.8.1 抗菌物質(zhì)粗物對黃曲霉孢子形態(tài)的影響

光鏡下觀察黃曲霉菌的正常孢子顏色發(fā)亮，外形圓滑，內(nèi)容物分布均勻且比較分散 (圖5A、B)。經(jīng)抗菌物質(zhì)粗物處理8 h后，孢子顏色變暗，聚集成團(tuán) (圖5C)。處理16 h后，孢子外形不規(guī)則，內(nèi)容物分布不均勻，有的內(nèi)容物開始流出，形成空腔(圖5D)。處理24 h的孢子邊緣模糊、胞壁出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象 (圖 5E)。

表8 發(fā)酵培養(yǎng)基各組分配比優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) (L27(313)) 及結(jié)果Table 8 The design and results of L27(313) orthogonal test for every proportion of fermentation medium

圖5 S24菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對黃曲霉孢子形態(tài)的影響Fig. 5 Effect of the antibacterial substances of S24 on spore morphoiogy of Aspergillus flavus. (A) Normal spore (×400). (B)Normal spore (×1 000); (C) Spores having been treated for 8 h (×400; Spores became gloomy and collective). (D) Spores having been treated for 16 h (×1 000; figure indicate irregular spore shape, uneven distribution of cellular contents, outflow of some inner substances from the cell, and empty cavity). (E) Spores having been treated for 24 h (×1 000; figure indicate fuzzy edge of the spores and breakage of cell wall).

表9 正交優(yōu)化培養(yǎng)基分析結(jié)果Table 9 Results of orthogonal design optimized fermentation medium

2.8.2 S24菌株對黃曲霉菌絲形態(tài)的影響

挑取拮抗圈邊緣菌絲鏡檢，發(fā)現(xiàn)大部分菌絲生長雜亂，菌絲變粗，顏色變暗，并且出現(xiàn)扭曲、皺褶等現(xiàn)象 (圖 6B)；有的菌絲細(xì)胞內(nèi)容物流出，出現(xiàn)空腔 (圖 6C)；部分菌絲細(xì)胞長度變短，中部膨大呈念珠狀，且有一些開始消融 (圖6D)。而對照組菌絲顏色鮮亮、粗長，表面光滑，內(nèi)容物分布均勻(圖 6A)。

圖6 S24菌株對黃曲霉菌絲形態(tài)的影響Fig. 6 Effect of strain S24 on mycelialmorphology of Aspergillus flavus. (A) Normalmycelia (×400). (B) Treated mycelia (×400; The mycelia disorder, coarsen, retorted and corrugated). (C) Treated mycelia (×400; outflow of inner substance and empty cavity in the mycelia). (D) Treated mycelia (×400; shortened, inflated and bead-like mycelia and partially ablated mycelia).

3 結(jié)論與討論

通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了 S24菌株發(fā)酵培養(yǎng)基配方，得到了適合S24菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基配方：淀粉10 g、葡萄糖40 g、黃豆餅粉24 g、酵母浸膏粉8 g、KH2PO44 g、CaCO30.8 g、水1 L。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方組分較少，抗菌物質(zhì)產(chǎn)量較高，發(fā)酵液效價(jià)較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了280.67%。

S24菌株及其抗菌物質(zhì)對黃曲霉菌絲及孢子均表現(xiàn)強(qiáng)烈的拮抗作用，顯微鏡下觀察，抗菌物質(zhì)作用于黃曲霉孢子后，可以使孢子出現(xiàn)聚集、內(nèi)容物分布不均、變形、空腔及胞壁斷裂等異常；S24菌株作用于黃曲霉菌絲后，使菌絲出現(xiàn)變粗、扭曲、皺褶、膨大、內(nèi)容物流出、消融等現(xiàn)象。

正交設(shè)計(jì)是從“均勻分散、整齊可比”的角度出發(fā)用正交表來安排少量的試驗(yàn)，從多個(gè)因素中分析出哪些是主要的，哪些是次要的，以及它們對實(shí)驗(yàn)的影響規(guī)律，從而找出較優(yōu)的工藝條件[10-13]。本試驗(yàn)中對于 C/N、無機(jī)鹽及最終培養(yǎng)基配方對抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響均采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，提高了工作效率和試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。同時(shí)，試驗(yàn)中對于無機(jī)鹽的研究采用營養(yǎng)限制方法，尋找到了對抗菌物質(zhì)產(chǎn)量影響最敏感的無機(jī)鹽。

拮抗鏈霉菌S24產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要成分由四烯和五烯兩類多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素組成，經(jīng)硅膠柱層析可將這兩類物質(zhì)完全分離[7]，進(jìn)一步通過RP-HPLC分離共獲得2種四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，6種五烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其中 6種五烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素的分子量已確定，與已有的五烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素差別較大，推測該菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)極有可能為一組新的多烯類抗菌物質(zhì)。要確定該抗菌物質(zhì)的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)還需通過進(jìn)一步的質(zhì)譜、核磁共振分析等。多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的原因，對紫外線較為敏感，不宜與陽光接觸，因此，限制了其在大田中的應(yīng)用，但在醫(yī)療、獸藥及食品和飼料的防腐方面都得到了較好的應(yīng)用，此外，多烯類抗生素是一類目前臨床常用藥中最不容易產(chǎn)生抗藥性的抗真菌抗生素[14-15]，開發(fā)高效低毒的多烯類抗真菌抗生素，是抗真菌藥物研發(fā)的有效途徑之一。本試驗(yàn)和前期試驗(yàn)結(jié)果表明，拮抗鏈霉菌S24是一株抗菌譜廣、發(fā)酵性狀優(yōu)異、遺傳穩(wěn)定的拮抗菌，產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)理化性質(zhì)穩(wěn)定，對多種糧食和飼料中常見的能引起人畜傳染性疾病的曲霉菌有強(qiáng)烈的拮抗作用，顯示了良好的應(yīng)用潛力，值得進(jìn)一步研究。S24菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制正在研究中。

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Medium optimization for antagonistic Streptomyces S24 and its inhibition on Aspergillus flavus

Qisheng Zhou1, Xunli Liu1, Nan Zhang2, Zhen Song2, Nianquan Qiu1, Benfeng Zhang1, Hui Guo2,Changxu Lü1, and Jian Yu1
1 College of Forestry, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China
2 College of Life Science, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China

Received: June 7, 2010; Accepted: August 25, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2001AA217061).

Corresponding author: Qinglin Zhang. Tel/Fax: +86-10-66930270; E-mail: qinglz@yahoo.com

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2001AA217061) 資助。